La replicació del DNA i la biosíntesi de les proteïnes a la Universitat

Unitat 7: La replicació del DNA i la biosíntesi de les proteïnes

El DNA com a material hereditari

Els primers experiments que van permetre identificar el DNA com a material genètic són:

Experiment de Frederik Griffith

Frederik Griffith va ser un bacteriòleg britànic que va treballar, en la década de 1920, amb el pneumococ o Streptococcus pneumoniae, un bacteri que causa pneumònia a humans i a animals. L'objectiu era descobrir una vacuna per a aquesta malaltia.

Hi ha dues soques* d'aquest bacteri: la S, que és patogena, i la R, que és innòcua.

Soca S patògena Soca R innòcua

Soca R viva Soca S viva Soca S morta Soques R i S mortes Cepa S viva

La injecció de pneumococs R (innocus) no produïa cap mal al ratolí.

Si s'injectaven bacteris vius S (patògenes) a un ratolí, l'animal moria i a la sang apareixien nombrosos pneumococs S.

La injecció de pneumococs S morts per la calor no produïa cap efecte al ratolí.

Si s'injectaven pneumococs R vius i pneumococs S morts, el ratolí moria i a la sang es trobaven pneumococs S vius, que es reproduïen transmetent aquest caracter S de generació en generació.

Griffith va concloure que una determinada molécula present als pneumococs S morts havia passat als pneumococs R vius i els transformava en S virulents.

Com que el carácter S adquirit es transmetia durant generacions, l'explicació més senzilla era que la molécula responsable s'havia integrat al genoma de la soca transformada.Al 1944, tres investigadors, O.Avery, M. McCarthy i C. McLeod, identificaren el factor de transformació (FT) que feia possible que els bacteris R es transformessin en bacteris S virulents

Tracten els pneumococs S morts per escalfament amb detergent per produir un lisat cel·lular (un extracte lliure de cèl·lules).

El lisat conté, entre altres: -polisacarid de la superfície cel·lular - proteïnes - RNA i DNA dels neumococs.

Tratamiento realizado sobre el lisado Resultado Conclusión

Ninguno El FT está presente en el lisado Mouse dies

Se añadió la enzima SIII, que degrada la cápsula de polisacárido Mouse dies El FT no era el polisacárido que estaba presente en el lisado

Se añadieron al lisado anterior (con el polisacárido degradado) las enzimas proteolíticas tripsina y quimiotripsina P Mouse dies El FT no era una proteína. Debía ser un ácido nucleico (ARN o ADN)

Se extrajeron los ácidos nucleicos del lisado anterior y se añadió la enzima ARNasa (que degrada el ARN) El FT no era el ARN Mouse dies

Al extracto de ácidos nucleicos anterior se le añadió la enzima ADNasa (que degrada el ADN) FT = ADN Mouse lives

3c) La prova definitiva la van obtenir el 1952 Alfred Hersley i Martha Chase que van demostrar de forma concloent que l'ADN i no una proteïna o l'ARN, era el material genetic del bacteriòfag T2

fosforo radiactivo en el ADN del virus 32P .P C-P P GP P P P

azufre radiactivo en la proteina del virus 35S 5 5 5 5 5 5

Amb aquests bacteriofags infecten E.coli i conclouen: - Els gens vírics consisteixen en DNA - Les cobertes víriques estan constituïdes per proteïnes

Activitat pàgina 140

La replicació del DNA

hydrogen bond 5' end 3' end P T A P P T A P P C G P P T A P A ... T P C G AT P G. C 3' end 5' end A .- T

Estructura secundària del DNA

Hauríeu de recordar ...

La composició del nucleotid, l'aparellament de bases complementàries, l'estructura de la doble helix del DNA, les hebres antiparalleles ...

La replicación del DNA és semiconservativa

En la replicació del DNA les dues cadenes se separen (es trenquen els enllaços entre les bases nitrogenades) i cada una de les cadenes actua com a motlle per la síntesi d'una nova cadena complementària.

La sintesi de la cadena nova es fa anant-se afegint el nt 1 a 1, a partir de la complementarietat de bases.

La molecula filla de DNA té una cadena de la molécula original i una cadena sintetitzada de nou (semiconservativa). Les molécules filles són identiques a l'helix inicial.

GC CG CG AKT GC IT>A TZA CG AKT G C A< T GC C TZA TA TA TA C CG c OG CG >A TA AKT AKT A<T AKT GC GCC AT A<T TA TA G GC

http://es.wikipedia.org/wiki/Replicación_de_ADN

Replicación semiconservativa

Hélice original de ADN

Hélices de ADN luego de un ciclo de replicación

FONT: http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema1.htm

La replicación del DNA és bidireccional

A partir de dos punts es deshibriden les dues cadenes i es comencen a copiar.

El bucle s'anirà obrint i s'aniran sintetitzant les cadenes en les dues direccions.

Els cromosomes bacterians tenen un únic origen de replicació (Ori C en E. Coli), mentre que els cromosomes eucariotes en tenen múltiples.

Replicación Semiconservativa y Bidireccional en E. coli

Hélice nueva Ori C Ori C Ori C PC PC PC PC

1ª Generación Hélice nueva

Un punto de origen (Ori C) y dos puntos de crecimiento (PC) El cromosoma de E. Coli es un Replicón (unidad de replicación)

Múltiples orígenes de replicación en los cromosomas eucarióticos

Origen Origen Origen Origen + Replicón Replicón Replicón Replicón

8Per desenrotllar cada volta de la doble cadena s'haurien d'introduir molts superenrotllaments positius.

• helicases
• SSBP
• DNA girasa o topoisomerasa

ADN ligasa ADN polimerasa (Pola) 3' Cadena retardada 3' 5' Fragment d'Okazaki 5' 5' Cadena líder 3' Topoisomerasa ADN polimerasa (Pol8) Helicasa Proteïnes d'unió a cadena única ADN primasa Encebador de l'ARNPer desenrotllar cada volta de la doble cadena s'haurien d'introduir molts superenrotllaments positius.

Activitats que relaxen els superenrotllaments

Hi ha activitats que relaxen aquests superenrotllaments:

• helicases: s'uneixen al ssDNA i trenquen els ponts d'hidrogen entre les cadenes
• SSBP (single-strand binding proteins): eviten en reaparellament
• DNA girasa o topoisomerasa: Compensa el desenrotllament de la helicasa i introdueix enrotllaments negatius. Les topoisomerases són enzims que tallen i tornen a unir el DNA per "desfer" nusos i girs.

La replicación del DNA és semidiscontínua

ADN Polimerasa cadena adelantada 5' Topoisomerasa 3' Helicasa x 5 cebador Lagging-strand template 5' fragmentos de Okazaki ADN Polimerasa

Experiments amb marcatges radioactius posen de manifest: - la sintesi de DNA té lloc de 5' a 3' - Cadena líder vs. hebra retardada - existència dels fragments d'Okazaki a la cadena retardada

La polimerasa només pot afegir nt en direcció 5'-3'. Aleshores, una de les dues cadenes de la forqueta es facil de sintetitzar i es fa de manera contínua. LIDER Ara bé, en l'altra cadena la polimerasa sintetitza petits fragments de 5'a 3', els fragments d'Okazaki. RETARDADA

Model bàsic de replicació

1. Desenrotllament (helicasa, SSBP, topoisomerasa)
2. Primasa: sintetitza un RNA encebador o primer (necessita DNA motlle, però no encebador). La primasa actua un sol cop sobre la cadena guia, i molts cops en la cadena retardada.
3. DNA polimerasa: és dimèrica. A partir de l'RNA encebador, genera el DNA. Necessita Mg2+ al seu centre de reacció.
4. Calen dNTPs

En el cas de la cadena retardada, una primasa també sintetitza l'encebador de RNA, i la DNA polimerasa va afegint els nt en direcció 5'-3', donant lloc als fragments d'Okazaki. Posteriorment la DNA pol elimina l'encebador, i el substitueix per nt. La DNA ligasa tanca la molécula.

Estudis en procariotes (E. coli)

DNA polimerasa I en E. coli

• té una sola subunitat
• no sintetitza la majoria del DNA, sinó aquell que uneix els fragments d'Okazaki, però és important
• necessita dNTPs i magnesi
• necessita un primer o encebador
• addiciona el nt el 3'OH del nt anterior
• processivitat moderada (uns 20 nt incorporats)

Activitats de la DNA pol I

• Polimerasa de 5' a 3' (sintesi de DNA)
• Exonucleasa de 3' a 5' (correcció d'errors)
• Exonucleasa de 5' a 3' (elimina l'encebador de RNA i corregeix errors)

DNA polimerasa II en E. coli

Activitats de la DNA pol II: repara errors.DNA polimerasa III en E. coli

• És un mulímer(a, B, ¿, ... ), però té moltes subunitats dimeritzades. Aquest fet és important perquè sintetitza DNA a dues bandes: a la cadena líder i a la retardada. La seva capacitat catalítica es deu a la subunitat B, que té forma de donut.
• sintetitza la majoria del DNA (el 95%)
• necessita dNTPs i magnesi
• necessita un primer o encebador
• addiciona el nt el 3'OH del nt anterior
• processivitat altíssima (uns 1000 nt incorporats)
• altíssima fidelitat, gràcies a l'activitat exonucleasa

Activitats de la DNA pol III

• Polimerasa de 5' a 3' (sintesi de la major part del DNA durant la replicació)
• Exonucleasa 3' a 5'

Cuadro 12.2 - PRINCIPALES ENZIMAS QUE ACTUAN EN LA REPLICACIÓN

Reparació d'errors i danys

Tant en eucariotes com en procariotes, la taxa d'error durant la replicació de la DNA polimerasa és inferior a 1 error per cada mil milions de desoxiribonucleòtids. (10-9)

És possible ja que:

• La DNA polimerasa és molt selectiva a l'hora d'incorporar les bases complementàries a la cadena motlle. Només s'equivoca en una base de cada 100.000 que incorpora (10-5)
• La DNA polimerasa té capacitat de correcció d'errors (subunitat & (épsilon) de la DNA pol III).
• Hi ha altres enzims correctors que poden tallar les bases defectuoses i corregir-les. Per exemple: reparació de nt per escissió, que és el mecanisme que utilitza la cellula per reparar els dimers de timina.