Tecniche di Analisi Genetiche – Parte 2: MLPA e NGS, modelli di trasmissione

Tecniche di Analisi Genetiche - Parte 2

Genetica Medica, Lezione 3, 12/03/2024
Prof. Massimo Negrini
TECNICHE DI ANALISI GENETICHE - PARTE 2
Il professore inizia la lezione con un riassunto di ciò che è stato spiegato nella precedente lezione riguardo al nuovo
macro argomento, ovvero le tecniche per le analisi genetiche. Si è parlato di tecniche di tipo citogenetico, per valutare
la struttura cromosomica, e tecnologie di citogenetica molecolare, che impiegano anche delle tecniche molecolari in cui
avviene il processo di ibridazione, per cui due molecole di DNA a singola elica si possono riassociare e possono essere
marcate per individuare una regione del cromosoma, come la FISH. Si è parlato poi di metodiche che analizzano invece
i singoli geni e la loro sequenza nucleotidica. Sono state trattate le due tecniche di base: elettroforesi e PCR.

Nella scorsa lezione sono statti trattati due metodi, ovvero il polimorfismo del DNA, in particolare dei
microsatelliti, e una elettroforesi capillare, che consente di distinguere la dimensione dei diversi loci
polimorfici.

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

È un ulteriore metodo che permette di evidenziare se all'interno di un gene sono presenti delezioni o
duplicazioni. È un saggio di PCR multiplex: a differenza della normale PCR che prevede l'utilizzo di una
coppia di primer per distinguere la porzione da amplificare, in questo caso le coppie di primer utilizzate sono
molteplici e lavorano tutte insieme nelle stesse condizioni per amplificare ciascuna un diverso segmento di
DNA, che nella maggior parte dei casi è all'interno dello stesso gene.

È una metodica utilizzata in diverse malattie genetiche abbastanza frequenti come l'Atrofia muscolare spinale
e la Distrofia di Duchenne (di cui parleremo più avanti), in cui i principali difetti genici sono dovuti a delle
delezioni.

Il prof. ora mostra un video per spiegare il funzionamento della MLPA (https://youtu.be/gfLJxKuqleY):
La fase di ibridazione dell'MLPA prevede l'utilizzo di due sonde, ma
solamente parte di queste andrà ad ibridizzare nel segmento di interesse. Le
due sonde si legano alla regione del DNA per omologia di sequenze. In realtà
non c'è solo una regione che viene legata dalle sonde, ma ce ne sono
molteplici.

Funzionamento MLPA: Ibridazione

How does MLPA work? | by MRC Holland
Hybridisation
DNA
4 0.54/7:16
How does MLPA work? | by MRC Holland
Hybridisation
Probe A
170 nt
Probe B
205 nt
Probe C
181 nt
DNA
· · 109/7:15
Esiste poi questo frammento verde, detto "stuffer", che non ha nessuna
omologia, ma si trova in ogni regione con dimensioni diverse, perché
consentirà, durante l'analisi dei frammenti, di stabilire quale regione è
stata amplificata guardando la dimensione dello stuffer.

1Quindi ci sono diverse sonde che presentano: due regioni che legano in modo
specifico un segmento di DNA da analizzare, una regione stuffer con
dimensione diversa per avere prodotti con dimensioni diverse identificabili
e infine due regioni alle estremità, nel video gialle e rosse, tutte identiche tra
loro (ma gialla # rossa). Queste porzioni sono i primer, che infatti devono
essere uguali perché devono amplificare le porzioni tutte nelle stesse
HI 4 1:16/7:16
condizioni; tutte le amplificazioni vengono quindi svolte con la stessa coppia di primer.

Funzionamento MLPA: Ligazione e Amplificazione

How does MILPA work? | by MRC Holland
Hybridisation
DNA
How does MILPA work? | by MRC Holland
Ligation
M + 1:43/716
Dopo aver svolto l'ibridazione, si aggiunge la ligasi, enzima che lega
tra loro due molecole di DNA, che chiude il gap rimasto tra le due
sonde. Nel caso ci sia un nucleotide appaiato male la ligasi non riesce
a legare le due porzioni.
Una volta avvenuto ciò, inizia la reazione di amplificazione tramite una
PCR semplice. Uno dei primer presenta una molecola fluorescente, quindi
può essere visualizzata. Alla fine, si avranno tanti frammenti fluorescenti che
vengono sottoposti ad una elettroforesi capillare, che consente di
visualizzare i pigmenti e i diversi frammenti.

Analisi dei Dati MLPA

PCR PRIMER MIX
Forward
PCR Primer
Reverse
PCR Primer
How does MLPA work? | by MRC Holland
A
Fragment Separation
REFERENCE SAMPLE 1
Fluorescence
Probes sorted by length (nt)
N 4 3:53 /7:16
How does MILPA work? I by MRC Holland
Data Analysis (by Coffalyser.Net)
TEST SAMPLE A
REFERENCE SAMPLES (average)
Fluorescence
Probes sorted by length (nt)
426/7:16
Qui si vede un campione test di cui si vuole valutare se ci sono state
delezioni o duplicazioni, che viene confrontato con un campione di
riferimento: si notano infatti due picchi mediamente più bassi (cerchiati
in rosso) negli esoni 7 e 8 del gene SMN1 responsabile dell'atrofia
muscolare spinale, per cui il gene ha subito una delezione di un allele.
Questo consente di valutare se il campione ha un
numero di coppie diploide normale. Nel caso ci
sia una delezione, nella regione si nota un
numero di coppie più basso, mentre nel caso di
un' inserzione il numero di coppie è più alto.
TEST SAMPLE Z
HETEROZYGOUS
DUPLICATION
TEST SAMPLE Y
15
HETEROZYGOUS
DELETION
15
Probe ratio
1
05
Probes sorted on genomic location
Probes sorted on genomic location
Probe ratio
1
05.
Una volta ottenuto il risultato questo va analizzato. Nell'immagine si nota
che la dimensione dei picchi è uguale più o meno per tutti i frammenti
amplificati.

DNA sequencing

2DNA sequencing
Le mutazioni più frequenti sono più sottili e riguardano pochi o singoli nucleotidi. Tra i modi più efficaci per
valutare una sequenza nucleotidica abbiamo il sequenziamento del DNA. Questa tecnica consente di
determinare l'ordine esatto dei nucleotidi presenti in un segmento di DNA.

Metodo Enzimatico di Sanger

I due scopritori, negli anni '70, sono stati William Gilbert, che sviluppo il metodo chimico, e Frederick Sanger,
che sviluppò il metodo biologico che oggi si usa (metodo enzimatico di Sanger), che si basa essenzialmente
sui principi della replicazione del DNA. Normalmente, il DNA può essere duplicato in vitro solo se nella
provetta si trovano: un filamento di DNA stampo, un primer come punto di innesco, una DNA polimerasi che
sintetizza il DNA e dei nucleotidi.

Sanger ha aggiunto poi dei nucleotidi modificati, i
P
PP
5'
BASE
O
(A.T. G, C)
dideossinucleotidi, che sono uguali ai normali nucleotidi ma
4
Deoxynucleotide (dNTP)
3'
2
mancano di un gruppo ossidrile (OH) in posizione 3'. Questo
OH
H
è fondamentale perché, normalmente, durante la sintesi del
PPP
.5'
BASE
O
(A,T, G, C)
4
1ª
DNA questa estremità 3'-OH forma un legame fosfodiesterico
3'
2
H
H
con il fosfato del nucleotide successivo; se però il gruppo OH
non è presente, questo legame non si può formare. Quindi, se un dideossinucleotide viene incorporato in una
molecola di DNA in via di sintesi, avviene una terminazione del processo in quel preciso punto. Per questo
motivo, il metodo di Sanger si chiama anche "Chain termination method" o "Dideoxy DNA sequencing".
Dideoxynucleotide (ddNTP)

Reazione di Sequenziamento di Sanger

Sanger Sequencing reaction
DNA Polymerase
Primer
5'
3'
3'
5'
DNA Template strand
dNTPs ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP )
+
ddNTPs (one of the four ddNTPs)
5'
3'
3'
5'
Partially replicated fragment
(es .: verde per il ddGTP, rosso per il ddCTP etc.).
Se a tutto ciò poi si esegue una elettroforesi capillare o su gel, i
frammenti si separeranno in base alla loro dimensione e ogni
frammento in una determinata posizione indica quale nucleotide è
presente in quella posizione. La rilevazione viene fatta attraverso un
rivelatore che indica quale fluoroforo è presente in una certa posizione.
Come risultato si ottiene, a computer, un cromatogramma con diversi
picchi di colore diverso; ad ogni colore corrisponde un nucleotide.
Quindi, nella rezione di sintesi del sequenziamento di Sanger
sono presenti piccole quantità dei quattro dideossinucleotidi,
che determinano saltuariamente l'interruzione della catena.
Questo metodo si utilizza oggi, dove ogni dideossinucleotide è
legato ad un fluoroforo di colore diverso, quindi ogni volta
che uno di questi viene incorporato, la catena sarà fluorescente
con colore diverso a seconda del tipo di dideossinucleotide
Machine: Cochise-1414-017
Lane: Ma
Spacing: 15.00
Bagrá: C: TTEN A: 2754 G: 2508 1:2019
NNACTCA TGTGSTOGA 110 CTATOCTG AC
G TGAT TOCLAC TỬ Q TRACTC TỔ AG GUAGA THÁC CÔNG GỖ CHAR ANG GIỜ TA TANG
TAR ACARGO CTRACY TO QUAGARAGAGA GARAGE TEAG Y TACACA TET TTATA TOLASCADA AG ECCO GEMAAKTEATT TRAGA
TATTOTAT TANTOTOGTGT TA FATT IGTCATARTEATRAAGTIGTGAGEGTATATT MANAGERACTO TTATAAGAACTOAATAA
ARATTAXA TAGGET TA TOTALATAGG TCCGTGTGGCTING OG STAAAAAAG TCBOCCA CCIACGCAG GANG ATGT AGAT ITGATCCT
20 OF TAG GARD ATCCC CTG GAGA AGGUATOAMARO CACTO TASTATIC 1 FACT008 ATCA 10010A0 10 8/800 78 0 80 0 C
FACAOTCCATOGGIOTOSCANAIDIOT TOGAGATO ACTAMACHACAAGATATAARATAACCT TACTO CATASTOTOAMACTTATGTCACAO
"AMATOCANDY TOTTACATO TATTACT FTATOOT TANTATARGETANTIGOACTOTTATAGAGA AGACTACT FT TT TATT TERZA

Analisi del Cromatogramma di Sanger

3Il prof. mostra ora un video per riassumere il sequenziamento di Sanger ("filmato 4" su Classroom):
Vediamo i dideossinucleotidi di colore diverso, miscelati insieme ai deossinucleotidi e alla DNA polimerasi. Abbiamo
poi un filamento di DNA stampo, con il primer legato ad una estremità. Avviene poi la sintesi di una nuova catena, che
si interrompe quanto si incontra un dideossinucleotide. A questo punto la miscela di frammenti viene sottoposta ad
elettroforesi capillare per capire come tutti questi frammenti sono strutturati. Questi si separano per dimensione e, con
l'utilizzo di un rilevatore, possiamo determinare quale nucleotide è presente in una specifica posizione.

Nel cromatogramma analizzato, le timine corrispondono a dei picchi rossi, le adenine a picchi verdi, le guanine
a picchi neri e le citosine a picchi blu. Tutto ciò serve ad analizzare frammenti di DNA che sono stati amplificati
mediante PCR. Il sequenziamento consente di sequenziare fino a 500-1000 nucleotidi per ogni reazione.

Nell'immagine si nota, nel riquadro, che oltre al picco rosso
ES382 - Chromas Lite
File
Edit
Options Help
+N
corrispondente ad una timina, si trova sotto anche un picco blu
Sample: ES382
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260
270
250
T
(citosina) più grande del background; significa che in quella
TGCAGGAACTGTTACACA TG TAG TT
280
posizione è presente una mutazione in una certa percentuale di
DNA dei prodotti di PCR. Abbiamo detto che ogni prodotto di
PCR è fatto di milioni o miliardi di molecole di DNA, quindi qui
vediamo la media dei nucleotidi presenti in quella precisa
posizione. È quindi un esempio di sequenziamento di Sanger che evidenzia in questa posizione una variante
nucleotidica, da T a C.

GTGGATGG
La sensibilità di questo metodo è del 10% circa, quindi se la mutazione si trova in meno del 10% dei frammenti
analizzati, è difficile da evidenziare.

Next Gen Sequencing (NGS)

Il sequenziamento di Sanger viene usato ancora molto spesso, ma via
via viene sostituito da questo sequenziamento di nuova generazione.
Per sequenziare il primo genoma umano ci sono voluti 10 anni, in
quanto il progetto è iniziato negli anni '90 e si è concluso all'inizio
degli anni 2000, con moltissimi laboratori impegnati e tanti milioni di
dollari spesi. Tutto ciò non è praticabile in larga scala, per tutte le
malattie che hanno impronte genetiche.

Science
nature
the
human
genome
THE
HUMAN
GENOME
Infatti la tecnologia è cambiata ed oggi un intero genoma umano può essere sequenziato in pochi giorni e con
poche centinaia di euro. Le tecnologie che si usano per ottenere questo tipo di sequenze, così ampie, si
chiamano Next Gen Sequencing.

4