Valutazione dei meccanismi di morte cellulare: necrosi e apoptosi

Morte cellulare

La cellula può morire attraverso due diverse vie: necrosi e apoptosi.

La necrosi è un evento accidentale e massivo, per il quale non esiste alcun farmaco che riesca a bloccarne il processo, quindi, a livello tossicologico interessa poco.

Oltre ad aumentare notevolmente di dimensione, le cellule che vanno incontro a necrosi e i loro organelli rivestiti da membrane si rigonfiano a causa dell'acqua che irrompe dalle membrane lesionate, rilasciando enzimi litici che digeriscono il contenuto cellulare, fino a quando la cellula va incontro a lisi e riversa il suo contenuto nell'ambiente circostante.

Le citochine rilasciate dalla cellula spesso inducono una risposta infiammatoria, che a sua volta può danneggiare le cellule vicine.

L'apoptosi è un processo fisiologico, è una morte programmata, anche se bisogna considerare che molti processi non fisiologici coinvolgono un errato meccanismo di apoptosi: quando c'è uno squilibrio del processo apoptotico, infatti, subentrano patologie molto comuni, come il Parkinson o l'Alzheimer, che si verificano in seguito neurodegenerazione.

Dal punto di vista morfologico, il processo apoptotico si distingue drasticamente dalla necrosi perché coinvolge una singola cellula apparentemente sana che perde i contatti intracellulari con le cellule circostanti.

Una serie di reazioni all'interno della cellula portano alla formazione di corpi apoptotici rivestiti da membrana che vengono in seguito fagocitati dalle cellule vicine o dai macrofagi circolanti senza riversare il contenuto cellulare e quindi senza indurre una risposta infiammatoria.

Cascata del segnale apoptotico

CD95 FADO Procaspase-8 DNA damage Caspase-8 Bel-2 Truncated bid Procaspase-3 Cytochrome c O AF Apoptosome Caspase-3 Smac/DIABLO Apat-1 Procaspase-9 UPS Apoptotic substrates

In una data cellula, l'apoptosi è caratterizzata da:

• momento di induzione: può essere dovuto a segnali estrinseci, che arrivano dall'esterno della cellula, o intrinseci, dall'interno del mitocondrio.

1. fase di esecuzione: vengono attivate specifiche peptidasi, le caspasi.

• Fase di formazione dei corpi apoptotici
• Fase di eliminazione dei corpi cellulari: al termine del processo, attraverso l'attività dei macrofagi, la cellula viene eliminata.

Di solito, quando bisogna studiare l'apoptosi si cerca sempre di accoppiare un test che analizza le fasi precoci con un test che valuta gli eventi quelli tardivi dell'apoptosi per essere certi che ogni meccanismo sia coinvolto.

Dal punto di vista tossicologico questo è importante in quanto, in base alla patologia che si vuole studiare, bisogna avere il giusto modello cellulare che richiami la malattia per verificare se si innesca il fenomeno apoptotico e in che modo.

Quando il modello cellulare è pronto, sarà possibile studiare le molecole che bloccano questi effetti.

Via intrinseca e via estrinseca

In una data cellula, l'apoptosi può essere indotta da segnali che arrivano dall'esterno o dall'assenza di segnali esterni che inibiscono l'apoptosi.

Via intrinseca (mitocondriale) Via estrinseca (innescata dai recettori di morte) Mancanza di fattori di crescita e di ormoni 1 Interazioni recettore-ligando . FAS · Recettore del TNF 1 Linfociti T citotossici Regolatori: 2 Molecole pro-apoptotiche p. es citocromo c Proteine adattatrici Membri della famiglia Bcl-2 Caspasi iniziatrici 1 Fagociti Danno Mitocondri Caspasi effettrici Granzima B · Radiazione · Tossine · Radicali liberi Danno del DNA 3 Attivazione di endonucleasi Distruzione del citoscheletro Frammentazione del DNA 4 Ligandi per recettori dei fagociti Gemmazione citoplasmatica Corpo apoptotico

La via estrinseca proviene da uno stimolo esterno: è innescata dall'associazione dei recettori di morte sulla superficie cellulare, un sottogruppo appartenente alla famiglia del recettore del fattore di necrosi tumorale TNF, con i loro rispettivi ligandi.

Il legame del ligando al recettore causa la dimerizzazione del recettore e la conseguente attivazione della caspasi-8.

La via intrinseca è innescata da una serie di stimoli che causano la depolarizzazione del mitocondrio con la formazione di porocanali da cui fuoriesce il citocromo-C, che si combina con una specifica proteina formando un complesso con la pro-caspasi-9.

La pro-caspasi 9 si attiva e attiva a sua volta tutte le caspasi arrivando a quelle effettrici che inducono morte cellulare tagliando le proteine del citoscheletro in punti specifici: la cellula cambia di conformazione e si formano i corpi apoptotici.

2 P53Si attivano anche delle endonucleasi che tagliano invece i frammenti di DNA.

Modificazioni morfologiche e biochimico-funzionali

Con il processo apoptotico si verificano delle modificazioni morfologiche biochimiche-funzionali specifiche che possono essere valutate con dei test:

• Modificazione delle dimensioni cellulari: la condensazione citoplasmatica provoca una contrazione cellulare
• Modificazioni della membrana plasmatica: cambia la distribuzione dei fosfolipidi di membrana. Durante lo stimolo apoptotico la fosfatidilserina (PS) trasloca dalla parte citoplasmatica alla parte extracellulare della membrana plasmatica.
• Modificazioni del mitocondrio: depolarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale e alterazione della permeabilità della membrana mitocondriale esterna con conseguente rilascio di citocromo-c nel citosol.
• Modificazioni citoplasmatiche: il rilascio di citocromo-c dai mitocondri provoca l'attivazione delle caspasi in grado di tagliare diversi substrati citoplasmatici e nucleari
• Modificazioni nucleari: la firma biochimica dell'apoptosi è la regolare frammentazione del DNA dovuta al taglio fra le unità nucleosomiali.

Valutazione dell'apoptosi su linee cellulari

Per qualsiasi test si intenda utilizzare va tenuto in considerazione il modello cellulare con cui si lavora:

• Cellule che crescono in sospensione, come le linfoidi, danno in genere pochi problemi e dati moto ben interpretabili perché le cellule sono già in partenza in sospensione.
• Nel caso si lavori con linee cellulari che crescono adese è necessario ricordare che sotto stimolo apoptotico parecchie cellule si staccheranno dal substrato solido: quando le cellule stanno morendo si staccano dal susbstrato e passano in sospensione; quindi, è importante recuperare queste cellule prima del distacco e includerle nella valutazione.

3Microscopia elettronica

È buona norma accoppiare più test per confermare che ci sia un coinvolgimento del processo apoptotico: solitamente si accoppiano dei test che vanno a colpire tutto il percorso di apoptosi, dalla fase di induzione a quella di esecuzione fino alla fase di terminazione con il richiamo dei macrofagi.

Cellule normali Apoptosi Necrosi

Dal punto di vista morfologico, se si utilizza la microscopia elettronica, è possibile osservare come la cellula si trasforma, proprio perché le cellule normali sono molto diverse da quelle necrotiche.

Ad oggi esistono dei microscopi time-lapse nei quali si inserisce direttamente la piastra in esame, e, dal momento che vengono mantenute le condizioni ottimali per la crescita cellulare, si possono riprendere le cellule in tutti i loro processi.

Con dei coloranti specifici è possibile distinguere queste varie fasi, che durano 3-4 ore, finché, nel frattempo, il microscopio effettua delle riprese che permettono di vedere poi in sequenza cosa accade alla cellula.

Si tratta di un test qualitativo.

Modificazioni nucleari: frammentazione del DNA nucleare

Histone octamer of nucleosome core Distance between cuts . multiple of 180 base pairs Linker DNA 700 Endonuclease DNA subjected to gel electro phoresis Base pairs 520 360 180

La frammentazione del DNA è un end-point dell'apoptosi, in quanto avviene ad opera di specifiche endonucleasi che tagliano il DNA in punti specifici, producendo dei frammenti nucleosomiali o oligonucleosomiali di 180-200 paia di basi.

4Cromatografia sul gel di agarosio

A B C D 2000 bp- 1000 bp- 500 bp 200 bp 100 bp

Il metodo più semplice per analizzare la frammentazione del DNA è la corsa di frammenti di DNA su gel di agarosio.

Si fa correre il DNA estratto dalle cellule su gel di agarosio.

In questo test si inseriscono i lisati cellulari all'interno di pozzetti (A,B,C,D) su gel di agarosio:

• nel pozzetto A si usa un DNA marker che dà informazioni sull'altezza dei lisati
• nei pozzetti B e C avviene il trattamento con una sostanza apoptotica che dà origine ad una serie multipla di bande, tipica della formazione di frammenti
• nel pozzetto D il composto non viene trattato con nessuna sostanza apoptotica, per cui si ha la formazione di una sola banda.

Quindi, ciò che si va a formare è un caratteristico pattern a righe dovuto alla formazione del DNA.

Una volta fatta la corsa elettroforetica si valuta in fluorescenza il DNA: se la cellula è sana si vede una banda sola integra, mentre se il DNA è frammentato si vedranno una scala di frammenti di DNA.

Kit Elisa per la frammentazione del DNA

Substrato ABTS Anti-DNA-POD 0 Frazione citoplasmatica contenente i nucleosomi Anti-istone-biotina Streptavidina adesa alla piastra di analisi

Un altro metodo più sensibile e costoso per valutare la frammentazione del DNA è il test immunoenzimatico ELISA.

5Si comprano dei kit in cui è presente una piastrina a 96 pozzetti, che equivalgono a 96 test, alla cui base c'è un gel, la streptavidina, che si trova adesa alla piastra di analisi.

Bisogna fare il cosiddetto sandwich, quindi in ogni pozzetto bisogna:

• introdurre un anticorpo anti-istone-biotina: permette di valutare la presenza dei degli istoni, ossia i frammenti del DNA che si sono formati durante il processo apoptotico. La biotina è una proteina che si lega alla streptavidina presente sulla superficie della piastra
• aggiungere un anticorpo anti-DNA con attaccato un sistema di rilevazione POD (perossidasi, enzima che permette di eseguire una colorazione).

Appena si è aggiunto tutto si deve lasciare la piastra in agitazione per 2-3 ore per far sì che si formi il legame tra i vari componenti.

Successivamente si effettuano dei lavaggi e poi si aggiunge il substrato ATBS, una sostanza che reagisce con la perossidasi dando una colorazione verde.

Più la colorazione è intensa, più saranno presenti frazioni contenenti nucleosomi nucleari: significa che il pool cellulare è in fase apoptotica.

A livello tecnico:

• il primo giorno si semina su una piastra lo stesso numero di cellule e si dà il tempo alla coltura cellulare di aderire al substrato
• Il secondo giorno si fa il trattamento con la sostanza in esame
• Si lisano le cellule per estrarre il DNA
• Il lisato si inserisce poi all'interno del sistema sperimentale dove si eseguono le reazioni sopracitate.

Citometria a flusso

Con il citofluorimetro si vanno ad isolare i nuclei delle cellule trattate con una soluzione ipotonica contenente propidio ioduro, una sostanza intercalante fluorescente che solitamente non entra nelle cellule se non hanno la membrana danneggiata.

Nei nuclei apoptotici c'è un minore contenuto di DNA per la formazione dei frammenti, al contrario dei nuclei normali in cui è presente maggiore DNA.

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