Aspetti quantitativi dell'interazione farmaco-recettore, Appunti

ASPETTI QUANTITATIVI DELL'INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE

INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE

La scorsa volta abbiamo visto che un farmaco, per produrre un effetto biologico, deve interagire con una molecola nel nostro organismo, sia essa una proteina, come nella maggioranza dei casi, un enzima o un recettore. Nell'immagine in alto vediamo proprio la natura di questa interazione farmaco-recettore. Abbiamo il nostro farmaco A che entra nell'organismo e incontra diverse molecole. Incontra la molecola B e la molecola C con le quali non riesce ad interagire in maniera stabile ma poi incontra un altro recettore ovvero il recettore D con il quale forma tanti legami e per questo si dice che abbia una certa affinità.

• Il legame farmaco - recettore è saturabile
• Il legame farmaco - recettore è caratterizzato (generalmente) da legami chimici deboli - l'interazione farmaco - recettore è (generalmente) reversibile
• L'interazione farmaco - recettore è selettiva

INTERAZIONE FARMACO RECETTORE: Cosa vuol dire questo?

Innanzitutto vuol dire che un farmaco lega il suo target in maniera selettiva (almeno idealmente), ovvero che dovrebbe legare un solo target biologico che è quello responsabile dell'effetto farmacologico e non dovrebbe legarne altri. Questa è una situazione ideale. Nella realtà succede invece che un farmaco sia dotato di una selettività non assoluta. In questo modo il farmaco lega preferenzialmente il suo target biologico sebbene a concentrazioni più alte possa interagisce anche con altri bersagli biologici. Più un farmaco è selettivo, più è sicuro pertanto bisogna mirare ad un'interazione quanto più selettiva possibile.

Generalmente l'interazione farmaco-recettore è saturabile. Significa che si ha un determinato numero di siti di legame, un determinato numero di recettori e una volta che si occupano tutti i recettori disponibili non se ne possono più legare altri. Anche continuando a somministrare il farmaco, nel momento in cui si ha saturato tutti i siti a disposizione per il legame, non si può più produrre più alcun effetto biologico (arrivo ad una sorta di "plateau" dell'effetto).

Inoltre, nella maggior parte dei casi, l'interazione farmaco-recettore è di tipo reversibile, ovvero è caratterizzata da legami chimici deboli. Raramente si ha un'interazione farmaco-recettore di tipo covalente 1ma piuttosto si avranno forze di van der Waals o legami idrogeno (legami chimici più deboli). Questo fa si che così come il farmaco ha legato il recettore, allo stesso modo il farmaco può staccarsi dal recettore. Ciò non vale per tutti i casi, si vedrà nella farmacologia speciale casi di farmaci che legano i propri target in maniera irreversibile (quindi tramite legami covalenti). Alcuni esempi sono l'aspirina che lega la COX2 in maniera irreversibile e alcuni inibitori della colinesterasi. Generalmente i farmaci da preferire sono quelli che interagiscono con il target in maniera irreversibile perché questo li rende più sicuri. Se al contrario un farmaco interagisce con il proprio target in maniera reversibile lo si può staccare dal suo recettore utilizzando ad esempio un antidoto. In poche parole, si è in una situazione in cui si può tornare indietro. Invece, quando avviene il legame irreversibile tra un farmaco e una proteina (recettore), quest'ultima non è più disponibile e si dovrò dare alla cellula il tempo di sintetizzarne di nuova (ovvero nuovo recettore). Pertanto, la reversibilità è un altro aspetto che rende il farmaco più sicuro.

Generalmente nei testi si trova descritta l'interazione farmaco-recettore utilizzando questa equazione: L+R<>LR L=ligando libero (ovvero il nostro farmaco) R=recettore libero LR=recettore legato al farmaco Questa equazione è caratterizzata da una Ka (ovvero da una costante di associazione) e da una Kd (ovvero da una costante di dissociazione. Conoscere questi parametri permette di dire quanto un farmaco è affine per un determinato recettore.

ESPERIMENTI DI BINDING

Radioligand binding assay

La prima cosa che vuole fare il farmacologo è studiare questa interazione farmaco recettore che è l'evento che da origine a tutto. Per studiare l'interazione farmaco-recettore si fanno degli esperimenti che si chiamano esperimenti di binding. Questi esperimenti si fanno generalmente in vitro in modo da eseguirli sul sistema più semplice che esprime il recettore. Un tempo si usavano anche i tessuti o gli estratti tissutali. Si prendeva un tessuto che si sapeva esprimesse il recettore di membrana di interesse (ad esempio l'aorta per il recettore alfa-adrenergico), si faceva un omogenato di cellule e si estraevano le membrane biologiche. Adesso la maggior parte degli esperimenti di binding si fanno utilizzando delle linee cellullari che esprimono il recettore ricombinante, ossia delle cellule in cui il biotecnologo ha transfettato il recettore (quindi cellule artificiali preparate affinchè esprimano una buona quantità di recettore). Anche in questo caso si fa un omogenato di cellule e si estraggono le membrane citoplasmatiche su cui sono espressi i recettori di interesse. Quindi, quando si parla di preparazione biologica che contiene il recettore, si parla di pezzi di membrana in cui è espresso il recettore di interesse. La prima cosa che serve è perciò proprio questo preparato biologico. Inoltre serve anche un farmaco tracciabile, rilevabile. Per farlo si usano dei farmaci radiomarcati. Questi danno la possibilità di capire quanto farmaco sia legato al recettore mediante la misura della radioattività del preparato. Oggi, oltre a questo sistema, si ha a disposizione anche altri strumenti, ad esempio l'utilizzo di farmaci marcati con la fluorescenza (meno impattante sulla salute dell'operatore). Il concetto di fondo rimane comunque marcare il farmaco affinchè si possa rilevare.

A questo punto si fa interagire per un certo tempo il preparato biologico che contiene il recettore con il farmaco radiomarcato e si avrà che una certa quantità di farmaco radiomarcato lega il recettore. Poi, si filtra il tutto. Il risultato è la perdita del farmaco in soluzione poichè rimane sulla membrana solamente la quota di farmaco che ha legato il recettore inquanto esso non riesce a passare attraverso i pori del filtro. Infine si va a misurare la radioattività di ciò che è rimasto sul filtro. Come si vede in figura, si ha una serie di provette e in ognuna si mette il preparato biologico che contiene il recettore e si aggiunge ad ogni provetta una concentrazione crescente di farmaco per poi andarne a misurare la radioattività. Successivamente si costruisce un grafico: sull'asse delle ascisse va posta la concentrazione di farmaco radiomarcato (radioligando) e sull'asse delle ordinate la radioattività. Guardando la curva T nell'immagine alla pagina precedente, si può notare che all'aumentare della concentrazione di farmaco aumenta la radioattività poichè aumenta la quota di farmaco che lega il recettore. Questa curva però tenderebbe all'infinito e questo non è chiaramente conciliabile con la teoria precedentemente espressa secondo cui il legame farmaco recettore è saturabile. Per questo motivo ci si aspetterebbe una curva che forma un plateau, non una che sale in maniera rettilinea. Cosa c'è che non va allora? Il problema è che il farmaco si lega altrove: sulla provetta, sul filtro, su una parte della membrana in cui non c'è il recettore, su molecole che non conosco e non riesco a prevedere. Quindi, con questo esperimento si 3misura la quantità di farmaco legato al recettore sommato alla quantità di farmaco che lega altro. Questo è il motivo per cui la curva tende all'infinito.

Insieme a questo esperimento che misura il cosiddetto binding totale, si deve fare in parallelo un esperimento che misura solo il binding non specifico. Come si fa? Si utilizza sempre la serie di provette dentro le quali si mette la preparazione biologica che contiene il recettore. Si procede inserendo concentrazioni sempre maggiori di ligando radiomarcato ma, stavolta, insieme ad un largo eccesso di ligando freddo (=farmaco non radiomarcato). Si eccede di molto in termini di quantità per assicurarsi che il ligando freddo vada ad occupare tutti i recettori disponibili. In questo modo l'unico spazio rimasto per il ligando radiomarcato è il binding non specifico (la provetta, la membrana, il filtro). Facendo questo esperimento si ottiene la retta che nell'immagine a pag. 2 è indicata con NS.

A questo punto si fa un'operazione matematica per cui si sottrae al binding totale il binding non specifico e si ottiene la curva indicata con specific binding. In questa curva se si aumenta la concentrazione di farmaco, aumenta la radioattività (significa che il farmaco si sta legando ai recettori). Ad un certo punto questa curva va a plateau (significa che tutti i recettori che si hanno a disposizione sono occupati). Qui si possono misurare due parametri fondamentali che definiscono le curve di binding:

• Bmax: lo si trova sull'asse delle y e corrisponde al plateau; da conto di quanti recettori/siti di legame si hanno a disposizione.
• Kd: costante di dissociazione, ovvero la concentrazione di farmaco con il 50% dei siti di binding occupati. La si trova trovo sull'asse delle ascisse.

Più è bassa la Kd, tanto più è alta l'affinità del farmaco per il recettore perché significa che basta una concentrazione bassa di farmaco per occupare il 50% dei siti disponibili.

Ora si analizzeranno alcune di queste curve.

ESPERIMENTI DI BINDING - ALCUNI ESEMPI

Questi sono 3 esempi di esperimenti di binding selezionati casualmente. Nel grafico in alto a sx abbiamo una preparazione che contiene il recettore per 5HT7 e il ricercatore che ha fatto questo esperimento ha deciso di valutarne l'affinità per la serotonina. Ha quindi radiomarcato la serotonina usando il trizio che è un atomo di idrogeno radioattivo e ha fatto l'esperimento com'è stato descritto precedentemente. Così facendo è riuscito a calcolare il Bmax (numero di recettori disponibili per il legame) e la Kd.