Replicación y Reparación del ADN en procariotas y eucariotas, Apuntes

Replicación y Reparación del ADN

X. REPLICACIÓN Y REPARACIÓN DEL ADN -0 Máster en Biología Molecular C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS- Índice

1. Dogma central de la biología molecular
2. Replicación del ADN

5 5

Replicación del ADN en bacterias

5

Replicación del ADN en eucariotas

Replicación del círculo rodante

6

1. Reparación del ADN

7 4 6Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos Objetivos Conocer el Dogma Central de la Biología Molecular Entender los mecanismos de replicación del ADN en procariotas y eucariotas Comprender los mecanismos de reparación del ADN. Ideas clave El Dogma Central de la Biología Molecular postula que el ADN contiene la información para la síntesis de ARN y proteínas. Según el Dogma Central, se pueden producir tres tipos de transferencias de información génica: las generales, las especiales y las desconocidas.

7 Las transferencias de información génica generales son las que ocurren en todas las células: replicación, transcripción y traducción. La replicación del ADN es el proceso mediante el cual el ADN hace una copia de sí mismo. Existen varios mecanismos de reparación del ADN. 3C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

Dogma Central de la Biología Molecular

El llamado Dogma Central de la Biología Molecular fue postulado por Francis Crick en 1958 y revisado por el mismo autor en 1970. Según dicho Dogma, el ADN contiene los genes, con la información para la síntesis del ARN y de las proteínas. Crick establece tres tipos de transferencias de la información: generales, especiales y desconocidas.

Las transferencias generales ocurren en todas las células. A partir del ADN, se puede sintetizar un ARNm, mediante un proceso denominado transcripción. Con la información contenida en el ARNm, se sintetizan las proteínas mediante un proceso llamado traducción. A su vez, solo el ADN puede hacer una copia de sí mismo (replicación o duplicación).

ADN 1 1 Proteína ARN

Transferencias del Dogma Central de la Biología Molecular

Figura 1. Transferencias del Dogma Central de la Biología Molecular Las transferencias especiales no ocurren en todas las células, pero pueden tener lugar en circunstancias especiales: de ARN a ARN, de ARN a ADN y de ADN a proteína). La copia de ARN a ARN y de ADN a ARN (retrotranscripción) tiene lugar en virus. Los virus pertenecientes a la clase de duplicación VI y VII de Baltimore, como, por ejemplo, los Retroviridae (como el VIH) y Caulimoviridae, tienen la capacidad de sintetizar ADN mediante una polimerasa, la transcriptasa inversa, empleando como molde ARN. Por otro lado, los ribozimas son moléculas de ARN con propiedades autocatalíticas, capaces de modificarse y duplicarse a sí mismos, en ausencia de proteína y ADN. Por último, in vitro existe la posibilidad de obtener proteínas, en un sistema libre de células y en ausencia de ARN, por lectura directa del ADN mediante ribosomas, en un entorno en presencia del neomicina (traducción en sistemas libres de ARN). Las transferencias desconocidas son las que el dogma central postula que no existen (proteína a proteína, proteína a ADN y proteína a ARN). Con el tiempo, se han descubierto una serie de elementos que implican la ampliación de este dogma. Estas excepciones atañen, entre otras situaciones o elementos, a los priones. Son proteínas libres de ácido nucleico, que se propagan sin que medie ningún tipo de duplicación o transcripción directa. Simplemente, afectan a proteínas de su misma secuencia, previamente existentes, alterando su conformación.

4 ọO Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Replicación del ADN

El proceso de replicación o duplicación es el que permite al ADN sintetizar una copia idéntica de sí mismo. De esta manera, a partir de una única molécula de ADN, se obtienen dos o más copias de la primera. Esta duplicación del material genético se realiza de forma semiconser- vativa. Las dos cadenas del ADN original se separan y cada una sirve de molde para la síntesis de la cadena complementaria. De este modo, cada nueva doble hélice contendrá una de las cadenas del ADN original. Aunque el procedimiento de replicación se desarrolla de manera similar en las bacterias y en las células eucariotas, existen varias diferencias en el mismo.

Replicación del ADN en bacterias

Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replica- ción, formando el llamado complejo de replicación o replisoma: helicasas, toposisomerasas, proteínas SSB, DNA polimerasas, RNA primasa, DNA ligasa. El proceso de replicación comienza con la separación de las hebras del ADN, como una cremallera que se abre, en un punto determinado denominado origen de replicación (oriC en Escherichia coli), gracias a la actividad de la proteína dnaA. A continuación, se forma la horquilla de replicación. La replicación del ADN en bacterias se realiza de forma bidireccional a partir del origen de replicación. Una vez formada la horquilla de replicación, se une gracias a la RNA primasa un cebador de ARN, que indica a la DNA polimerasa su lugar de unión. Esta DNA polimerasa será la que sintetice la hebra complementaria mediante la unión de nucleótidos a la cadena en formación. Continúa añadiendo nucleótidos complementarios hasta encontrar la secuencia de terminación. Las helicasas son las enzimas responsables de la ruptura de los puentes de hidrógeno que permiten el avance de la horquilla de replicación. En E.coli, las helicasas que actúan son las proteínas dnaB y rep. Además, la proteína SSB estabiliza al ADN desenrollado. La acción de las helicasas provoca en la cadena de ADN circular torsiones y superenrollamientos que deben de ser eliminados para que continúe la replicación. Las topoisomerasas (en el caso de E. coli, la girasa) son las responsables eliminarlos. La replicación siempre se produce en sentido 5'-3'. De esta forma, una de las hebras del ADN se replicará de forma continua (cadena adelantada) y la otra de forma discontinua (cadena retrasada). La cadena retrasada está formada por los fragmentos de Okazaki, que van a unirse entre sí gracias a una DNA ligasa.

5C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O Las DNA polimerasas tienen, además de la actividad polimerasa, actividad exonucleasa 3'-5', que le permite eliminar las bases mal apareadas o erróneas del extremo 3' de la cadena en formación.

Replicación del ADN en eucariotas

El material genético de las células eucariotas está compuestos por varios cromosomas, es decir, varias moléculas de ADN lineales. A diferencia de las bacterias, en las células eucariotas existen diferentes puntos de origen de la replicación. Así, las células eucariotas replican su ADN en pequeñas porciones, llamadas replicones. Cada replicón tiene su propio origen de la replicación, desde el cual avanza la horquilla de replicación en ambas direcciones. El proceso que ocurre dentro de cada horquilla de replicación es similar al de las bacterias, aunque las enzimas y proteínas implicadas difieren ligeramente. Por ejemplo, las proteínas ORC son las que reconocen y se unen al origen de replicación. También son diferentes las helicasas (Mcm en levaduras), las proteínas estabilizadoras del ADN de cadena sencilla (RPA) y las DNA polimerasas.

Replicación del círculo rodante

La replicación del círculo rodante es un proceso de replicación unidireccional, que permite sintetizar rápidamente múltiples copias de las moléculas circulares de ADN o ARN tales como plásmidos o el genoma de bacteriófagos y virus de células eucariotas. La replicación del ADN comienza con el corte en una cadena en el origen de replicación. El extremo 5' se aleja del dúplex, permitiendo la adición de nucleótidos al extremo 3' libre, usando como molde la cadena complementaria. A la vez, el extremo 5' de la cadena cortada se despliega como una cadena libre de tamaño cada vez mayor. Cuando toda esta cadena se ha desplegado, el extremo 3' se disocia de la cadena complementaria. La maquinaria de replicación corta y liga los dos extremos formando nuevamente una molécula de ADN monocatenaria y dejando tras de sí un ADN circular de doble cadena, una de las cadenas es de nueva síntesis y la otra corresponde a la cadena molde. La molécula de ADN monocatenaria sintetiza su hebra complementaria.

6 ọO Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Reparación del ADN

Tomas Lindahl, Paul Modrich y Aziz Sancar obtuvieron el Premio Nobel de Química de 2015 por sus estudios acerca de los mecanismos de reparación del ADN. Existen diferentes procedimientos mediante los cuales las células identifican y reparan los daños en el ADN. Los principales son:

• Reparación sobre la marcha: es el principal sistema de corrección de daños. Lo realizan las propias DNA polimerasas I y III en bacterias y las DNA polimerasas gamma, delta y epsilon en eucariotas, con su actividad exonucleasa 3'- 5' para corregir un nucleótido equivocado que hayan colocado. Esta incorrección es detectada porque el emparejamiento incorrecto causa una distorsión de la doble hélice que las ADN Polimerasas pueden detectar. Sin embargo, la reparación solo puede realizarse si aún no se han puesto más nucleótidos, una vez colocado aunque sea uno más, éste actúa como barrera de no retorno.
• 7 Reparación directa: no requiere eliminación de nucleótidos o bases nitrogenadas, sino que se emplean enzimas para reparar directamente alteraciones nucleotídicas. Por ejemplo, la fotoliasa separa los dímeros de timinas formados por radiación UV y la metiltransferasa retira grupos metilo añadidos al ADN.
• Reparación por escisión de base (BER): que repara daños a un único nucleótido causados por oxidación, alquilación, hidrólisis o desaminación. Una glicosilasa de ADN reconoce la alteración y escinde la base nitrogenada del nucleótido dañado, generando un sitio apurínico o apirimidínico. Se han identificado glicosilasas espe- cíficas para distinas alteraciones, como la presencia de uracilo, la 8-oxo-guanina o la 3-metil-adenina. La endonucleasa AP corta el ADN en dicho punto y la polimerasa beta, gracias a su actividad fosfodiesterasa, elimina el azúcar-fosfato remanente que estaba unido a la base eliminada. A continuación, la misma polimerasa beta inserta el nucleotido complementario a la cadena no dañada y la ligasa de DNA III une la cadena.
• 7 Reparación por escisión de nucleótido (NER): repara daños que afecten cadenas más largas, de entre dos y treinta bases. Este proceso reconoce cambios grandes que distorsionan la hélice, como dímeros de timina, así como roturas de cadena única. Se conocen dos vías de NER: la vía acoplada a la transcripción y la vía global. En la vía acoplada a la transcripción (TCR) se repara el ADN de los genes que se están transcribiendo activamente, mientras que en la vía global se corrigen los errores en el resto del genoma. En ambas vías, en primer lugar se reconoce el daño en el ADN. Este reconocimiento está mediado por la proteína XPC en la vía global y en la vía acoplada a la transcripción una polimerasa de ARN junto con una proteína CSB. A continuación, se separan las cadenas de ADN, gracias a las proteínas XPB y XPD (dos subunidades de helicasa de TFIIH). Luego, la proteína XPG produce el corte en el extremo 3' y el 7