Hibridación de Ácidos Nucleicos: técnicas y aplicaciones en Biología

Hibridación de Ácidos Nucleicos

XX. HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
-0 Máster en Biología Molecular
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CENTRO
EUROPEO
DE MASTERS
Y POSTGRADOS- Índice

1. Hibridación de ácidos nucleicos

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1.1 Características de las sondas de hibridación
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1.2 Marcadores de sondas de hibridación
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1.3 Marcaje de sondas de hibridación
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1. Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos

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2.1 Southern-blot
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2.2 Northern-blot
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2.3 MLPA
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2.4 Microarrays de ADN
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1. Aplicaciones de las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos

10Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos
Objetivos
Comprender los principios de hibridación de ácidos nucleicos.
Conocer las técnicas de Genética y Biología Molecular basadas en la
hibridación de ácidos nucleicos.
Aprender las aplicaciones de las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos.
Ideas clave
La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de moléculas de
ácidos nucleicos complementarias.
Para las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos se usan sondas
marcadas con isótopos radiactivos, fluorocromos o enzimas.
Las principales técnicas de hibridación con ácidos nucleicos son el Southern-
blot, Northern-blot, microarrays, FISH, hibridación in situ y MLPA.
El Southern-blot permite la identificación de fragmentos de ADN, transferidos
a una membrana, mediante la hibridación con sondas complementarias.
El Northern-blot permite la identificación de fragmentos de ARN, transferidos
a una membrana, mediante la hibridación con sondas complementarias.
El MLPA permite detectar grandes defectos genéticos, como pérdidas o
duplicaciones de exones de un gen.
Los microarrays de ADN o chips de ADN permiten estudiar la expresión de
miles de genes simultáneamente.
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Hibridación de Ácidos Nucleicos

1. Hibridación de ácidos nucleicos
En los primeros años de la década de los 60 del siglo pasado, Julius Marmur y Paul Doty
publicaron un estudio en el que describían las condiciones para la óptima renaturalización de
las cadenas complementarias de ADN, después de la desnaturalización por alta temperatura.
Pronto quedó claro que se podía usar esta capacidad de renaturalización para la identificación
de secuencias de ADN complementarias.
La hibridación es la unión de complementaria de ácidos nucleicos (ADN o ARN). Se basa
en la unión entre nucleótidos complementarios, como ocurre en la estructura del ADN. Los
nucleótidos de Citosina de una cadena de ADN o ARN se unen a los de Guanina de la otra
cadena de ácido nucleico mediante 3 puentes de hidrógeno, mientras que los de Adenina se
unen a los de Timina (ADN) o a los de Uracilo (ARN) mediante 2 puentes de hidrógeno.
La hibridación es la base de numerosas técnicas moleculares que permiten identificar o, incluso,
localizar físicamente moléculas de ácidos nucleicos en muestras problema. En estos casos,
es necesaria, además de la muestra problema con la molécula de ADN o ARN a estudiar, una
sonda complementaria a la misma.

Características de las sondas de hibridación

1.1 Características de las sondas de hibridación
Una sonda es una molécula de ARN o ADN homóloga a la secuencia de ADN o ARN diana,
con la que hibrida por asociación de las bases complementarias. Las sondas se pueden
obtener mediante clonación de fragmentos de ADN, RT-PCR o mediante síntesis química de
los oligonucleótidos. Idealmente, han de cumplir las siguientes características:

• Tamaño: 20-30 nucleótidos (depende de la técnica).
• 7 40-60% de la secuencia compuesta por C-G.
• 7 Sin secuencias complementarias dentro de la sonda que formen estructuras secun-
  darias.
• 7 No más del 70% de homología con otras secuencias del genoma distintas de la
  secuencia diana.
• 7 No más de 4 bases iguales seguidas.
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Marcadores de sondas de hibridación

1.2 Marcadores de sondas de hibridación
Para facilitar la detección de la hibridación, las sondas se marcan de manera que no afecte
a su capacidad de unión a la secuencia complementaria. El marcaje de la sonda puede ser:

• 7 Directo: la sonda lleva unida un marcador que se puede detectar directamente
• 7 Indirecto: la sonda está unida a una molécula o grupo indicador que será detectado
  posteriormente por un anticuerpo.
  Los marcadores más empleados son:
• 7 Isótopos radiactivos: el más usado es el 32P, aunque también son usados 35S,3H,125|
  y14C. Emiten radiación beta que es detectada, generalmente, mediante una película
  autorradiográfica.
  Fluorocromos: son grupos que emiten fluorescencia, que puede ser captada
  mediante fluorimetría. Los más empleados son los derivados de la rodamina y de
  la fluoresceína.
  Enzimas: como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa. Para poder visualizarlos es
  imprescindible añadir, después de la reacción de hibridación, un sustrato de la enzima.
  En ocasiones da lugar a un producto coloreado, que se puede medir mediante espec-
  trofotometría. En otras ocasiones produce quimioluminiscencia.
  Los grupos indicadores más usados en el marcaje indirecto son:
  Biotina: se une a la sonda. Se detecta mediante su unión específica con avidina o
  estreptoavidina marcada. También se puede detectar mediante anticuerpos anti-biotina
  marcados. Tanto la avidina como la estreptoavidina o los anticuerpos anti-biotina
  pueden estar marcados con fluorocormos o con enzimas.
• 7 Digoxigenina: esteroide proveniente de plantas del género Digitalis. Se detecta mediante
  anticuerpos anti-digoxigenina marcados con un fluorocromo o una enzima.

Marcaje de sondas de hibridación

1.3 Marcaje de sondas de hibridación
Las sondas se pueden marcar mediante distintos métodos de marcaje. Algunos de ellos
modifican propios nucleótidos de la sonda (nick translation, random primer), mientras que
otros le añaden un marcador terminal a la misma (método tailing, método con nucleótido
quinasa, método fill-in end-labeling):

• Nick translation: una DNasa rompe aleatoriamente los enlaces fosfodiester de los
  nucleótidos de la sonda produciendo mellas (nicks). Una DNA polimerasa introduce
  en esos huecos nucleótidos marcados con un isótopo radiactivo.
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• 7 Random primer: se realiza una PCR, empleando cebadores aleatorios (random
  primers). Se utilizan nucleótidos marcados (solo un tipo de los 4 necesarios) que la
  DNA polimerasa va a ir incorporando a la sonda.
  Método tailing: mediante una desoxinucleotil-trasferasa terminal, se añade al extremo
  3' del oligonucleótido una pequeña cola terminal de nucleótidos marcados.
  Metodo con polinucleotido quinasa: marca el extremo 5', mediante el intercambio del
  P terminal por otro marcado.
  Método fill-in end-labeling: con una enzima de restricción se corta la sonda, generando
  extremos cohesivos. A continuación, con la DNA polimerasa I se añaden dNTPs
  marcados al extremo 3' de la sonda.
• 7 Marcaje externo de la sonda: la sonda se une a otra molécula que lleva el marcador.
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Técnicas de Hibridación de Ácidos Nucleicos

2. Técnicas de hibridación de ácidos
nucleicos
En los laboratorios de Biología Molecular y Genética, así como en otros laboratorios biomédicos
se utilizan numerosas técnicas basadas en la hibridación de ácidos nucleicos, en las que se
utilizan sondas marcadas (radiactivamente, con fluorescencia, generalmente). Las principales
son: el Southern-blot, Northern-blot, microarrays, FISH, hibridación in situ y MLPA.
El FISH es una técnica citogenética que emplea sondas marcadas con fluorocromos para
identificar secuencias concretas en los cromosomas. Por su parte, la hibridación in situ
permite localizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico en el que se encuentra
permitiendo analizar su distribución en células y tejidos.
En esta unidad didáctica nos centraremos en las técnicas de Southern-blot, Northern-blot,
microarrays y MLPA.

Southern-blot

2.1 Southern-blot
La técnica de Souther-blotting o Southern-blot fue desarrollada por Edwin Southern en 1975.
Permite la identificación de moléculas de ADN, empleando sondas complementarias marcadas
con isótopos radiactivos o con fluorescencia.
El procedimiento consiste en los siguientes pasos:

• Extracción del ADN
• Electroforesis en gel de agarosa: separación de los fragmentos de ADN, en función
  de su tamaño.
• Desnaturalización: en una solución alcalina se desnaturalizan los fragmentos de ADN
  ya separados. Se forman hebras de ADN monocatenarias.
• Transferencia: se transfiere el ADN a una membrana de nitrocelulosa o de nylon.
  Se coloca el gel en una cubeta con una solución tamponada con alta fuerza iónica.
  Encima del gel se coloca la membrana y unos papeles de filtro. Finalmente, se pone
  encima un peso para favorecer el flujo del tampón.
• Hibridación: con las sondas de ADN o ARN específicas.
• 7 Revelado: la posición de las bandas unidas a las sondas se revela utilizando una placa
  autorradiográfica.
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Northern-blot

2.2 Northern-blot
La misma técnica del Southern-blot puede emplearse con moléculas de ARN. En ese caso se
denomina Northern-blot (un juego de palabras con el apellido del autor de la técnica para el
ADN). Fue desarrollada por Alwine, Kemp y Stark.
El procedimiento consta de los siguientes pasos:

• Extracción del ARN
• 7 Electroforesis: en gel de agarosa con formaldehído, ya que favorece la posterior
  desnaturalización del ARN. Para fragmentos muy pequeños se usan geles de polia-
  crilamida.
• Desnaturalización con formamida
• Transferencia: también en presencia de formamida
• Fijación a la membrana de las muestras de ARN con luz ultravioleta
• Hibridación
• Revelado

MLPA

2.3 MLPA
El MLPA o Multiplex ligation-dependent probe amplification es una técnica descrita en 2002
por Schouten y colaboradores. Permite detectar grandes defectos genéticos, como pérdidas
o duplicaciones de exones de un gen, lo que puede implicar la obtención de una proteína
truncada y sin función o una enzima inactiva.
La MLPA permite la amplificación de múltiples fragmentos de ADN con un único par de cebadores.
Además, emplea dos sondas marcadas con fluorescencia para cada uno de los exones del
gen, que reconocen lugares adyacentes del ADN. Una sonda contiene la secuencia reconocida
por un cebador y la otra sonda la del otro cebador. Solo cuando ambas sondas hibridan con su
secuencia complementaria, se ligan formando una única sonda. A continuación se amplifican
por PCR. Cada sonda da lugar a un amplicón de un tamaño diferente, lo que permite distinguir
unos de otros. Se separan mediante electroforesis capilar. Cada amplicón da lugar a un pico
de fluorescencia distinto cuyo tamaño es proporcional a la cantidad que existe.
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