Identificazione della composizione chimica del materiale genetico

Identificazione della Composizione Chimica del Materiale Genetico

Esperimenti di Griffith, Avery, Macleod e Mc Carty

• Primo esperimento che ha fatto pensare alla natura chimica del materiale ereditario sono gli esperimenti di Frederick Griffith in Streptococcus pneumoniae (anni 20 del '900).
• Lo stesso esperimento è stato svolto successivamente (1930/40) dai ricercatori Avery, Macleod e Mc Carty. Essi hanno ripetuto l'esperimento di Griffith in modo più moderno, in vitro, e cercando di capire cosa fosse effettivamente il principio trasformante. Si cercò di mettere a contatto un estratto cellulare di un batterio IIIS con capsula (dà polmonite) con un IIR.

1. Hanno coltivato batteri IIIS in una beuta e ne hanno fatto un estratto cellulare: essi sono separati dal supernatante e le cellule si rompono a dare un filtrato; in questo modo si ottengono solo le componenti chimiche, ovvero il contenuto cellulare sotto forma di estratto composto da frammenti di batteri morti.
2. Quali possono essere le componenti del principio trasformante? Per i ricercatori l'informazione genetica era considerata estremamente complessa, perciò qualcosa di questo genere doveva risiedere necessariamente in una struttura molecolare altrettanto complessa, come le macromolecole cellulari: acidi nucleici (DNA, RNA) o proteine. Per capire quale fosse la componente chimica che equivalesse al principio trasformante, l'estratto dei IIIS fu diviso in tre provette, alle quali vennero aggiunti degli enzimi che degradassero specifiche componenti: RNasi, proteasi, DNasi.
3. Questi filtrati cellulari vennero poi messi a contatto con i batteri IIR, per essere trasformati dal principio trasformante.
4. I ricercatori notarono che nei filtrati trattati con RNasi e proteasi i batteri IIR venivano comunque trasformati in IIIS, anche in mancanza di RNA e di proteine. Di conseguenza né l'RNA né le proteine possono essere il principio trasformante, perché sono stati degradati.
5. La provetta trattata con DNasi, al contrario non permette la trasformazione, questo ci conferma che il DNA è il principio trasformante.

Batteri di tipo IIIS (virulenti) Uccidere al calore i batteri virulenti, omogeneizzare e filtrare Filtrato di batteri di tipo IIIS 2 Trattare i campioni con enzimi che distruggono le proteine, I'RNA o il DNA. RNasi (frammenta I'RNA) Proteasi (disgrega le proteine) DNasi (rompe il DNA) 3 Aggiungere i campioni trattati a colture di batteri di tipo IIR Batteri di tipo IIR Batteri di tipo IIR Batteri di tipo IIR Batteri di tipo IIIS e di tipo IIR Batteri di tipo IIIS e di tipo IIR Batteri di tipo IIR 4 Le colture trattate con proteasi o RNasi contengono batteri di tipo IIIS trasformati ... 5 ... mentre la coltura trattata con DNasi non ne contiene.

Obiezioni e Ulteriori Esperimenti

Obiezione: i preparati sono realmente puri, quindi esenti dalle altre componenti? Questo esperimento non è stato accettato nonostante la forte evidenza. La comunità scientifica non approvava questa ipotesi, poiché i preparati utilizzati potevano essere poco puri. In realtà non si approvava questo risultato a causa della troppa semplicità del DNA, costituito da un linguaggio a 4 lettere (Adenina, Timina, Citosina, Guanina); un linguaggio così limitato non poteva giustificare la così alta variabilità genetica, sarebbe stato più plausibile che il principio trasformante fossero le proteine, avendo un linguaggio ben più complesso, a 20 lettere. La comunità scientifica decise, quindi, di fare ulteriori esperimenti, che diedero conferma dell'ipotesi iniziale.

Esperimento di Hershey e Chase con Batteriofago T2

1. L'esperimento di Alfred Hershey e Martha Chase mediante batteriofago T2 fuga ogni dubbio (1952)

0. Come scegliere l'organismo modello? Il batteriofago scelto è del tipo virulento, che attua un ciclo litico. Essi si rivolgono a questo tipo di fago perché si tratta dell'organismo vivente dotato del materiale genetico più semplice in assoluto, DNA all'interno di un capside costituito da proteine. Si è concepito un esperimento il cui risultato fosse univoco: il materiale genetico è costituito da DNA o da proteine? La scelta è alternativa e questo tipo di discriminazione si può fare attraverso l'utilizzo di isotopi radioattivi, ovvero per aggiunta di un elemento radioattivo che decade emettendo energia.

1. Per impostare l'esperimento bisogna pensare alla composizione di DNA e proteine:
   • DNA: contiene fosforo, per evidenziarlo si usa il marcatore p32
   • Proteine: contengono zolfo, per evidenziarle si usa il marcatore $35
   A questo punto posso creare due popolazioni fagiche radioattive per i due isotopi.
2. Come si producono le particelle fagiche marcate? Bisogna far crescere i virus in batteri che hanno già incorporato gli isotopi radioattivi. Per avere dei batteri marcati (es. E. coli) è necessario che questi vengano nutriti con degli isotopi in forma di sale radioattivo (solfato di ammonio). A questo punto i batteri produrranno anche proteine radioattive, quindi al momento dell'infezione il fago normale incorpora gli amminoacidi radioattivi per sfruttare la macchina di sintesi del batterio. Questi fagi marcati di s35 vengono poi riprodotti e usati per infettare un altro batterio.
3. Bisogna separare la componente fagica da quella batterica: Per poter discriminare tra proteina e DNA bisogna bloccare lo scambio nel preciso momento dell'infezione fagica, prima della lisi cellulare, altrimenti ciò che è all'interno e ciò che è all'esterno si mescolerebbe inquinando i risultati. Si stacca la particella fagica dal batterio meccanicamente, attraverso l'ausilio di frullatori. Da questo processo si ottiene una sospensione di fagi e batteri.
4. Bisogna suddividere il supernatante (liquido di coltura) dai corpuscoli: Dispongo la sospensione in centrifuga per separare il supernatante dalle componenti cellulari, che essendo pesanti si impaccano sul fondo della provetta. Il supernatante, in cui è contenuto ciò che è rimasto fuori dalle cellule, si analizza e risulta essere molto radioattivo, perciò contiene solfato radioattivo.
5. Ripeto l'esperimento marcando i batteri con il p32 specifico per il DNA: Questa volta si osserva che la radioattività è tutta nelle cellule e non nel supernatante. In conclusione: quando la radioattività è utilizzata per marcare le proteine, s35 rimane fuori dalle cellule, mentre quando la radioattività è utilizzata per marcare il DNA, p32 è dentro le cellule, da qui si deduce che sia il DNA ad entrare nelle cellule come principio trasformante.

Dettagli dell'Esperimento 1

Esperimento 1 1 Infettare E. coli cresciuto in un terreno contenente 55S. 2355 viene preso dalla proteina del fago, che contiene S ma non P. 3 Staccare il rivestimento proteico nel miscelatore ... A ... separando le proteine dalle cellule mediante centrifugazione. 5 Dopo la centrifugazione, si recupera l'355 nel fluido contenente i rivestimenti virali Proteina E. coli 0 +355 Radioattività nel rivestimento proteico DNA Riproduzione fagica 55 55 Infettare E. coli non marcato 6 Nella progenie fagica non viene rivelata radioattività.

Dettagli dell'Esperimento 2

Esperimento 2 1 Infettare E. coli cresciuto in un terreno contenente 35p. 2 12P viene preso dal DNA del fago, che contiene P ma non S. 3 Staccate il rivestimento proteico nel miscelatore ... 4 .. separando le proteine dalle cellule mediante centrifugazione. 5 Dopo la centrifugazione, i batteri infettati formano un residuo solido contenente 32p nella parte inferiore della provetta. Proteina E. coli 0 32p DNA S 32P Riproduzione fagica Fago T2 Infettare E. coli non marcato Radioattività nella cellula 6 La progenie fagica è radioattiva.

Risultati degli Esperimenti di Hershey e Chase

Capsula proteica marcata con "S DNA marcato con #p 1) I virus infettano i batteri 2) I virus vengono staccati dalle cellule con il frullatore 3) Cellule e virus vengono separati per centrifugazione L'S si trova nel supernatante ma non nelle cellule Il P si trova nelle cellule ma non nel supernatante Fago T2

Struttura del DNA

Componenti Chimiche del DNA

2Struttura del DNA Componenti chimiche: fosforo, deossiribosio (zucchero), 4 basi azotate (A-T-C-G)

• Nucleotide: struttura base pentagonale con l'ossigeno sulla punta e il fosfato (senza gruppo P = nucleoside).
• Ribosio: generalmente ha una struttura lineare ma la forma che costituisce l'RNA è una forma furanica circolarizzata. La circolarizzazione avviene tra il carbonio in posizione 1 e quello in posizione 4 (i numeri vanno dall'1 al 5 e si riferiscono agli atomi di C del ribosio).

H. 10 5 5 HOH2C OH H HOH2C H (OH) hemiacetal 4 H HO I formation H 13 T2 OH OH OH OH a & ß-D-ribofuranose

• Deossiribosio: stessa struttura dell'RNA, derivante dall'eliminazione di un ossigeno in posizione 2.
• Basi azotate: sono suddivise in purine, adenina e guanina, con una struttura base a due anelli e pirimidine, citosina e timina, con una struttura base ad un solo anello.

Assemblaggio e Orientamento del DNA

Assemblaggio completo: La base azotata è legata al c1, il c2 è in forma ossi o deossi, il fosfato è legato in 5', l'ossidrile in posizione c3 si unisce con legame fosfodiesterico al fosfato in c5 del nucleotide successivo. Questo legame necessita di catalisi da parte dall'enzima DNA polimerasi, perché si tratta di un legame covalente, quindi ad alta energia e che non si dissocia. Abbiamo un'estremità della catena che comincia con il fosfato in 5' e termina in 3' con l'ossidrile. Possiamo, quindi, dire che il DNA ha orientamento 5' -> 3'. La catena nucleotidica è legata covalentemente con questo orientamento e la sequenza specifica dei nucleotidi, essendo un legame forte, è fissa e può cambiare soltanto per mutazione.

NH &CH HC OH HO-P-O-CH2 B 0 H VH .C. HN4 C-CH, 0 H O=CAN CH HO-P-O-CH2 .0 B 0 H H H H CH O-P-O-CH2_O O-P-O-CH2_O. O-P-O-CH2_O O-P-O-CH __ O H H H H H H OH H OH H HO-P-O-CH2 .0- ₿ H H H H + 3 OH H (1) Un gruppo fosfato: 0 0-P=0 (a) Nell'RNA: Ribosio (b) Nel DNA: 2-Desossiribosio OH (2) Uno zucchero a 5 atomi di carbonio o pentoso: s CH, OH s CH 0 OH H H OH OH OH H Manca il gruppo ossidrilico (a) Solo nell'RNA (con poche eccezioni): (b) Sia nell'RNA che nel DNA: (c) Solo nel DNA (con poche eccezioni): O NH2 O H-N3 C-H H-Na SC-CH3 0=C2 -H 0= -H 0=Č2 C-H H H Uracile Citosina Timina Pirimidine NH2 C-H H-C N-H Adenina 0 H-N C-H NH2- N-H Guanina Purine L'unità di misura del DNA è il paio di basi o pair base (bp), perché la catena di DNA è doppia, ma l'unità di misura convenzionale è il kilobase (Kb), equivalente a 1000 nucleotidi. O NH CH HN N 0 N 0 0 0 Z-6 CH 0 H 0=C2 -Z H H H H OH H OH H Deossiadenosina 5'-monofosfato (dAMP) NH2 N HN N N N H.N 0 0 H H H H Deossiguanosina 5'-monofosfato (dGMP) Deossitimidina 5'monofosfato (dTMP) 20 OH (H) H 13 12 OH OH 5CH2OH D-ribose CH2OH H H-2-OH H rotate about H-3-OH = 4k H H 1 C3-C4 bond H4-OH OH 3 12 =0 4 H H C1 (3) Una base ciclica contenente azoto: -2-I H H Deossicitidina 5'-monofosfato (dCMP) 3 O 5' H N. NH2 1 N O 5