Ciclo dell'acido citrico: reazioni e regolazione del ciclo di Krebs

Biochimica, Lezione 19, 13/10/2021

Prof.ssa Nicoletta Bianchi CICLO DELL'ACIDO CITRICO In questa lezione andremo ad analizzare qual è il destino dei gruppi acetilici e l'ossidazione di questi gruppi a CO2 durante il ciclo dell'acido citrico.

Il ciclo inizia con l'Acetil-CoA che

0 O Condensazione di Claisen: il Deldrogenazione: Acetil Co.A gruppo metilico di un acetil-Co.A Tousidarione del gruppo -OHl completa CH-C -- 8-CoA Citrato la sequenza delle viene convertito in gruppo metilenico nel citrato. dona il gruppo acetilico (cioè 2 carboni) · ogni gruppo acetilico genera 2 CO2 omidazioni e genera CoA-SH un carbonile Deidratazione/ reidratazione: il gruppo Ossalacetato -OH del citrato viene HO-6-000" riposizionato nell'isocitrate . la molecola di Ossalacetato viene rigenerata posizionato in modo da facilitare la condensazione di Clausen nella tappa all'Ossalacetato (composto a 4 atomi di per perparare la successiva decarbossilarione della 0 tappa successiva. · Le ossidoriduzioni conservano l'energia nei coenzimi ridotti NADH Malato e FADH, Carbonio) formando il Idratazionei malase dell'acido citrico l'aggiunta di Citrato dis-Aconitate gli intermedi a 4C e 5C sono i doppio precursori biosintetici per altre legame introduce un 0-coo molecole (composto a 6 atomi di C) che viene gruppo -OH Tutte le reazioni avvengono nei (3) NADH mitocondri successiva tappa di ossidazione. convertito in Isocitrato (sempre a 6 Albert (Reidratazione) Lehninger Fumarate ( H| HI-C- atomi di C). L'Isocitrato a sua volta O VADIL HO-C-H Isocitrato C Decarbossilazione Deidrogenazione: CH-000 Tintroduzione di un doppio legame da inizio co alla sequenza di nacini Col decarbossilazione stabilizzando il Succinato 000 carbanione formate CoASH a.Chetoglucarate carbonio adiacente. CH CoA-SH sull'acomo di ouidazione del metilene, omidativa: il gruppo -OHl viene ossidato a carbonile, che a sua volta favorisce la viene deidrogenato e decarbossilato in Eugene Kennedy a-Chetoglutarato (5 atomi di C) che GTP CO viene ulteriormente decarbossilato per ATP GDP Decarbossilazione C Succinil-Co. ossidativa meccanismo Fosforilazione a livello del substrate: l'energia del tioestere viene conservata nel legame fosfoanidridico del GTP o dell'ATP. simile a quello della piruvato deidrogenasi, dipendente dal carbonile sul carbonio adiacente. (ADP) + P generare Succinato (a 4 atomi di C). Il Succinato viene poi convertito mediante una reazione a tre tappe in Ossalacetato concludendo il ciclo e rigenerando appunto la molecola di Ossalacetato. Ogni gruppo acetilico ha 2 atomi di C e produce quindi 2 molecole di CO2 mentre non vi è un consumo netto di Ossalacetato perché la molecola consumata viene degenerata; quindi, basta una molecola di Ossalacetato per ossidare in teoria un numero infinito di gruppi acetilici e per questo la sua concentrazione è bassa nelle cellule. Inoltre, è da osservare che 4 su 8 reazioni sono reazioni di ossidoriduzione e che l'energia viene conservata nei coenzimi ridotti NADH e FADH2 . Il ciclo di Krebs, però, non si limita a degradare composti organici per produrre energia conservata in questi coenzimi ma serve anche a produrre intermedi come quelli a 4 e 5 atomi di C che rappresentano dei precursori per la biosintesi di altri composti. Nel 1948 Albert Lehninger e Eugene Kennedy hanno scoperto che i mitocondri sono la sede della fosforilazione ossidativa nelle cellule eucariotiche. Dunque, i mitocondri contengono non solo tutti gli enzimi e i coenzimi del ciclo dell'acido citrico ma anche quelli della fase successiva necessari al trasferimento degli elettroni da questi cofattori NADH e FADH2 per la produzione di ATP. Sempre nei mitocondri sono localizzati anche gli enzimi che servono per l'ossidazione di acidi grassi ad acetil-CoA e di alcuni amminoacidi ad acetil-CoA, Ossalacetato, Succinil-CoA o a-chetoglutarato. Il lavoro che è stato fatto da Lehninger e Kennedy ha chiarito molti aspetti relativi alla funzione mitocondriale nella cellula nonostante essi non abbiano ricevuto Nobel. Negli eucarioti fotosintetici, ad esempio, i mitocondri sono la sede di produzione dell'ATP al buio, quando l'ATP non è prodotto sfruttando la luce nei cloroplasti. Invece, i batteri assomigliano ai mitocondri perché contengono gli enzimi nel citosol o nella loro membrana con funzione analoga a quella mitocondriale.

Logica chimica del ciclo

Per estrarre completamente il potenziale energetico dei gruppi acetilici è necessario degradarli completamente a CO2 ma l'ossidazione diretta di una molecola di Acetil-CoA è un processo che biochimicamente non può avvenire. Si formerebbe il CO2 e metano che non sarebbe degradabile fatta eccezione per batteri che vivono in alcune nicchie o batteri intestinali che hanno gli enzimi per farlo. Mentre i gruppi metilenici CH2 sono facilmente metabolizzati da enzimi presenti in molti organismi. Questi operano riduzioni del tipo CH2 adiacente a un gruppo carbossilico quindi molto reattivo per le caratteristiche di cariche delocalizzate con una carica positiva sul carbonio che lo rende capace di attrarre elettroni e quindi può formare un carbanione sull'atomo di carbonio adiacente per delocalizzazione della carica negativa Nu Composto carbonilico (carbonio ibidrizzato sp?) Intermedio tetraedrico (carbonio ibidrizzato sp3) del carbanione quindi per ossidare in modo efficiente l'acetil-CoA deve +H20 CoA. H2C-COO restare legato qualcosa, problema che O=C-COO O + CoA-C OH-C-COO I viene risolto legandolo all'ossalacetato HỌC-COO CH3 H-C-COO citrato sintasi che risolve la scarsa reattività del gruppo Ossalacetato Acetil-CoA Citrato metilico attraverso la sua condensazione sull'ossalacetato con formazione di un gruppo metilenico. Le tappe 1,3 e 4 sfruttano gruppi carbonilici correttamente posizionati, ogni reazione del ciclo coinvolge una reazione di ossidazione che è necessaria per conversione di energia oppure per posizionare correttamente i gruppi funzionali favorendo le reazioni della carbossilazione ossidativa.

Formazione del Citrato

Acetil Co.A 11,0 Cak NHI HỒ-000 10-0-000 CH, -COO Aceil Ca.A 0-C-000 CIL -000 Omsalacetabs Citrato sintasi 3G* - - 32,2 kj/mole Il legame toessere dell'sorti-Co& attiva gli Mregeni mesilici e l'Asp ?? ) curse un protone dal gruppo mitdico formando un intermedio atn. L'Sintermedio è stabilizzato da un legame birogrno e/o dalla protonsfictif dalriti.i'd (viene mostrata la pros completa).

1. l'atomo di C del gruppo metilico del gruppo acetilico dell'Acetil-CoA si lega al gruppo carbonilico C2 dell'Ossalacetato
2. con formazione di un intermedio transitorio legato all'enzima, il Citroil-CoA,
3. che va incontro a rapida idrolisi precodentemconse codusa, L'1Bis porta come un acido semplice.
4. e liberazione dei prodotti CoASH 1-8-&Cok HO-0-000 O HO-6-000 (H,-000 Citroil-Cal CH2-000" Citrate rigcerrando Cak-SH e liberando citrats.

Il ciclo dell'acido citrico ha 8 tappe, la prima è la condensazione di un tioestere e di un chetone dell'acetil-CoA con l'ossalacetato per formare citrato, catalizzata dalla citrato sintasi nella quale l'atomo di carbonio del gruppo metilico del gruppo acetilico dell'acetil-CoA si lega al C2 dell'ossalacetato con formazione di un intermedio transitorio legato all'enzima, il Citroil-CoA, che va incontro ad una rapida idrolisi per formare i prodotti che sono subito rilasciati dal sito attivo. L'idrolisi dall'intermedio tioestere ad alta energia rende la reazione altamente esoergonica e quindi la reazione è irreversibile.

Citrato sintasi

La citrato sintasi è stata cristallizzata ai raggi x e possiamo vedere che è formata da un omodimero (2 domini funzionali: uno grande e rigido e uno piccolo e flessibile) e il sito attivo si trova tra i due domini. Possiamo vedere come in seguito al legame con i substrati avvenga una variazione conformazionale.

Anales Osalacetate BC-coo Analoga 2(a) (b) Ossalacetato Acetil-CoA L'ossalacetato si lega per primo al dominio flessibile (vedi immagine a) inducendo un'estesa modifica della conformazione creando il sito di legame per il secondo substrato che è l'acetil-CoA (visibile nell'immagine b). Quando si forma l'intermedio, il citroil-CoA, una seconda modifica conformazionale causa l'idrolisi del tioestere e il rilascio del coenzima A. Questo adattamento indotto serve a evitare delle scissioni prima premature del tioestere che non sarebbero produttive.

Formazione dell'Isocitrato

La seconda tappa del ciclo di Krebs è la trasformazione reversibile del Citrato in Isocitrato catalizzata dall'aconitato idratasi e attraverso la formazione di un intermedio che è il cis-Aconitato, che non si dissocia H dal sito attivo. L'aconitato idratasi contiene un centro ferro-zolfo, attraverso il quale può aggiungere una molecola d'acqua al doppio legame dell'intermedio in due modi. Il primo modo porta alla produzione di Isocitrato, mentre il secondo porterebbe, essendo una reazione reversibile, alla produzione di Citrato. Nella cellula, la reazione è spinta verso la formazione dell'Isocitrato proprio perché questo viene rapidamente consumato nella tappa successiva del ciclo di Krebs.

Reazione di formazione dell'Isocitrato

2º reazione: formazione dell'Isocitrato univers degli St di Ferra CH2-COO H2O CH2-COO H2O H-C-COO HO-C-COO C-COO aconitasi aconitasi HO-C-H H-C-COO C-COO COO H Isocitrato Citrato cis-Aconitato AG'º = 13,3 kJ/mole

Meccanismo di azione dell'Aconitato idratasi

Citrato H H O O S -CH2 Cys-S Fe S H C -000 CH : B Cys-S S Fe S-Cys Reazione catalizzata dall'Aconitato idratasi Università degli Studi di Ferrara [4Fe-45] cluster Asp- 100 ... His 101 Asp- 100 *** His+ 101 H2O H H 1 H2O H - O pro-S ooc Arg+ 580- *** "OOC H coo' Arg+ 580 coo Ser 642- 0 pro-R Ser 642 -0-H* Citrate cis-Aconitate intermediate 180° flip Asp" 100 - -. His 101 - Fe Fe- - 5 H H,O - Fe Asp" 100 ... His+ 101 Fe H-0 H H2O H .. Arg+ 580 coo Arg+ 580 .... OOC COO C COO Coo Ser 642 -0": Ser 642 - O -H. (2R,35)-Isocitrate La molecola d'acqua potrebbe essere prodotta eliminando il protone da uno qualunque dei due bracci carbossimetilici, CH2COOH, ma in realtà questo non avviene perché l'enzima catalizza la rimozione da quello inferiore. L'Aconitato idratasi, infatti, lega il substrato ossia il Citrato ma in modo sensibile a quella che è la stereospecificità della molecola ed è quindi in grado di distinguere tra questi due gruppi carbossimetilici.

a) CH2COO- Citrato C SOH - CH2COO Si 3 COO E 3 Sito attivo dell'aconitasi b) CH2COO Citrato c COO CH2COO No OH E Ł V H Fe 0 Fe S In questa slide viene descritto il meccanismo di azione coinvolto sia nel legame del substrato sia nell'addizione o rimozione della molecola d'acqua. 3 ... I-C CH2-COO .Fe- S