Intermedi del ciclo di Krebs come oncometaboliti, Università degli Studi di Ferrara

Intermedi del ciclo di Krebs

Ripartiamo dalle ultime reazioni trattate, avevamo visto la Fumarato idratasi che è un'enzima del ciclo di Krebs che presenta una stereo specificità. Anche questo enzima come l'Aconitasi è selettivo per un isomero del Fumarato, infatti, l'isomero CIS , che si chiamerebbe Maleato, non viene riconosciuto dall'enzima. La Fumarasi può catalizzare anche la reazione inversa e quindi , a questo punto, anche la reazione inversa è specifica per un enantiomero cioè L-Malato.

Ci sono due enzimi, uno citoplasmatico ed un mitocondriale che possono svolgere questa funzione. Molti degli enzimi del ciclo di Krebs sono presenti nel citosol. A questo punto mostra questa diapositiva (non trovo la diapositiva corretta) che sarà più chiara dopo aver fatto il metabolismo degli amminoacidi. Potrete quindi comprendere quello che è il collegamento tra il ciclo dell'acido citrico, dove gli scheletri carboniosi vengono utilizzati per la produzione di energia, ed il ciclo dell'Urea dove la porzione amminica degli amminoacidi verranno secreti come Urea.

Questi due cicli sono connessi attraverso quello che è detto shunt dell'Aspartato Arginino-succinato che prevede la collaborazione di questa Fumarato idratasi citosolica che converte il Fumarato in Malato per poi tornare nella matrice mitocondriale.

L'ultima reazione riguarda la trasformazione del Malato in Ossalacetato, quindi , nel composto di partenza, quella che dà inizio al ciclo. Teniamo presente che questa reazione avrebbe un valore AGO' molto positivo quindi ci si aspetterebbe che non fosse possibile compierla, in realtà la concentrazione di Ossalacetato nella matrice mitocondriale è talmente bassa che il AG reale, invece, risulta essere minore di 0 e la reazione può compiersi nelle condizioni ottimali della cellula.

La prof. Sottolinea che invierà una serie di link Zanichelli tramite Classroom (immagino si tratti di esercizi simili a quelli che verranno poi messi nella prova d'esame).

Definire esattamente il bilancio energetico del ciclo di Krebs è stato un compito abbastanza macchinoso per i biochimici perché per ottenerlo bisogna fare l'analisi totale della cellula (mitocondri + citosol) - mitocondri/citosol.

Perché, come più volte ripetuto, alcuni enzimi lavorano in entrambi i compartimenti (isoforme di Citrato sintasi,Fumarasi,Aconitasi ecc che sono anche a livello citosolico) questo ha reso poco immediato riuscire a definire quello che è il bilancio energetico preciso in un solo distretto cellulare.

Tutto sommato, facendo un resoconto, siamo riusciti a tirare un po' le somme, in questa diapositiva si trovano le reazioni reversibili ed il loro dispendio energetico.

Enzimi regolatori del ciclo di Krebs

Come possiamo dedurre il ciclo di Krebs è un ciclo che, per ottenere dell'energia, ne consuma comunque un gran quantitativo, questo perché molte reazioni hanno un AG molto vicino allo zero.

Importante, come la Glicolisi, perché fornisce degli intermedi che possono essere utili in altre vie metaboliche.

Vediamo come le uniche reazioni che presentano un AGO' ma anche AG reale piuttosto negativo in realtà sono solo quella catalizzata dalla Citrato sintasi e da queste due deidrogenasi. Tutte le altre reazioni possono andare in entrambi i sensi a seconda dell'accumulo degli intermedi di riferimento.

Ad esempio, il Fumarato può essere trasformato in Malato ma se si accumula il Malato perché non utilizzato allora la reazione potrebbe anche funzionare al contrario.

Tutto questo perché alcuni di questi intermedi (come il Citrato) possono essere usati in altre vie.

Cosa determina il flusso? Le reazioni con AG minore di zero quindi la Citrato Sintasi e le Deidrogenasi (sono detti, quindi, enzimi regolativi).

Quali sono gli aspetti regolatori del Ciclo di Krebs? Innanzitutto è regolato dalla quantità di Ossalacetato ed Acetil Co-A che deriva dalla Piruvato Deidrogenasi.

Importante ricordare che NON abbiamo, a questo livello, delle reazioni metaboliche che trasformino il Citrato in Ossalacetato o che trasformino l'Acetil Co-A in Piruvato.

Regolazione del ciclo di Krebs

In questo caso l'entrata nel ciclo di Krebs è determinata da questi due metaboliti e da quanto è efficace la Piruvato Deidrogenasi nel catalizzare la De-carbossilazione ossidativa.

Altri aspetti da cosa dipendono? In primis dalla concentrazione del prodotto che viene generato e che, a sua volta, può inibire l'enzima. L'accumulo del prodotto in molte reazioni va ad inibire l'enzima stesso (es Citrato che inibisce Citrato Sintasi). Abbiamo anche la possibilità che un prodotto di reazioni molto più avanti nel ciclo di Krebs può accumularsi e può andare ad inibire la Citrato Sintasi.

L'enzima che regola, quindi, il flusso metabolico nel Krebs è la Citrato Sintasi sotto controllo metabolico del suo prodotto e del Succinil Co-A (prodotto più avanti). Più di un metabolita che dà inibizione per Feedback negativo.

Ancora, sempre Succinil Co-A , può inibire anche l'enzima Isocitrato Deidrogenasi.

Deduciamo, quindi, che gli enzimi chiave sono regolati in più modi e da più inibitori.

Lo stesso ed unico ATP prodotto può inibire l'Isocitrato Deidrogenasi perché se l'ATP prodotta NON viene utilizzata allora non ha senso continuare il Krebs. Gli effetti sono principalmente a livello della Citrato Sintasi e delle Deidrogenasi.

Abbiamo poi un modulatore secondario, il Calcio, che va determinare un aumento del ciclo di Krebs perché servirà maggior energia per la contrazione muscolare ( unico stimolatore).

Il principale prodotto del Krebs è il NADH che è una delle molecole a potenziale energetico prodotte nel Krebs (la sua concentrazione nella matrice aumenta con la velocità del ciclo) ed andrà ad inibire tutti e tre gli enzimi.

Il NADH è quindi il principale regolatore perché gli inibisce tutti, poi abbiamo il Citrato che è specifico sulla Sintasi e poi il Succinil Co-A che inibisce l'isocitrato deidrogenasi e la citrato sintasi; l'ATP è specifica per l'iscocitrato deidrogenasi.

Influenza dell'Acetil-CoA sul Piruvato

L'Acetil Co-A è importante poiché se si accumula nella cellula vuol dire che il Krebs non sta lavorando con una velocità adeguata quindi non sta producendo molto NADH perché, magari, non c'è bisogno.

Se non c'è bisogno l'Acetil Co-A deve dire alla Piruvato deidrogenasi che il Piruvato è meglio utilizzarlo per generare Glucosio nei tessuti gluconeogenici in grado di produrlo.

Dalle Deidrogenasi vengono prodotte le forme ridotte del NAD+ quindi il NADH ( 3 molecole) e FADH2 (1 molecola) ed ATP/GTP ( 1 molecola)+ CO2 generata dal ciclo dell'acido citrico.

Teniamo presente che la CO2 deriva dalla porzione anteriore della molecola ( NON dal gruppo acetilico in entrata) ma dal rimaneggiamento dell'Ossalacetato.

Non solo il NADH dal circlo di Krebs entrerà nella catena di trasporto insieme al FAD ma anche le molecole di NADH generate dal PDH e dalla Gliceraldeide 3-P deidrogenasi nella glicolisi.

N.B Tutto, alla fine, viene convogliato nella catena di trasporto!

Come detto, la catena di trasporto degli elettroni riguarda la membrana interna del mitocondrio ma questi NADH sono esterni.

Ri-ossidazione delle molecole di NADH e FADH2

Come fa, quindi, ad essere utilizzato nella catena di trasporto se non c'è un trasportatore di NADH tra Citosol e mitocondri? Oggi vedremo questo.

Ritornando, quindi, al bilancio energetico dalla molecola di Glucosio fino alla produzione di NADH (sommando Glicolisi, PDH e Ciclo di Krebs) andiamo a vedere che otteniamo un certo numero di ATP e NADH (ricordandoci che si formano 2 molecole di Piruvato quindi va tutto moltiplicato per due).

1. Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (glicolisi)
2. Piruvato deidrogenasi
3. Enzimi del ciclo dell'acido citrico:
   1. Isocitrato deidrogenasi
   2. a-Chetoglutarato deidrogenasi
   3. Succinato deidrogenasi (solo FADH2)
   4. Malato deidrogenasi