Spettrofotometri: principi e componenti per analisi UV-Vis e IR

Componenti principali

Spettrofotometri

1. Sorgente di luce
2. Selettore di lunghezze d'onda
3. Contenitore del campione
4. Rivelatore di radiazioni
5. Elaboratore del segnale e dispositivo indicatore

Configurazione per misure di assorbimento

SORGENTE - MONOCROMATORE CAMPIONE RIVELATORE SISTEMA DI ELABORAZONE E PRESENTAZIONE DATI Configurazione per misure di assorbimento in UV-vis

SORGENTE CAMPIONE MONOCROMATORE RIVELATORE - SISTEMA DI ELABORAZONE E PRESENTAZIONE DATI Configurazione per misure di assorbimento in IR

Sorgenti per assorbimento molecolare

0Sorgenti Per le determinazioni in assorbimento molecolare è necessaria una sorgente continua, la cui potenza non cambi bruscamente in un intervallo considerevole di l

Sorgenti comuni per misure di assorbimento in UV-vis

Lampada a filamento di tungsteno (vis) Filament - 100 Blackbody radiator Graybody (e = 0.422) 10 Tungsten M1 , W cm-2 pm-1 1 0.1 0.01 0.001 0.1 1 10 60 Wavelength, um

Lampada a D2 (UV) 10-1 E,, uW cm-2 nm-1 10-2 10 -3 200 300 400 500 600 700 A, nm

Lampade a deuterio

• Sono lampade a scarica - lo spettro è prodotto da un arco che si forma mediante eccitazione elettrica del gas deuterio gas (D2) che riempie la lampada.
• Ampio spettro nella regione dell'UV (< 400nm).
• Tempi di vita lunghi (oltre 4000 h) ed eccellente stabilità.
• Possono funzionare sia con corrente continua che alternata.

Sorgenti per assorbimento in IR

0Sorgenti Sorgenti comuni per misure di assorbimento in IR Sono costituite da un solido inerte riscaldato elettricamente a T tra 1500-2000 K: la radiazione continua così prodotta si avvicina a quella di un corpo nero. La massima intensità radiante si ha intorno a 2 mm poi diminuisce lentamente fino a circa l'1% del massimo a | > 15 mm.

Platinum lead Glower Reflector Platinum wire heater Platinum lead Filamento di Nernst. Cilindretto di materiale semiconduttore (ossidi di terre rare) lungo 20 mm e ø 1-2 mm, alle cui estremità sono saldati dei conduttori di Pt per permettere il passaggio di corrente e il raggiungimento di T tra 1200 e 2200 K 2444

La sorgente Globar è una candela di carburo di Si (ø 5mm, lunga 50mm) riscaldata elettricamente a circa 1500 K. È necessario raffreddare i contatti elettrici per evitare la formazione di un arco. Lo spettro è simile a quello prodotto dal filamento di Nernst, ma ha una maggiore efficienza a l < 5 mm.

Incandescent Light Sources Sorgenti a filo incandescente sono costituite da una spirle di Ni-Cr riscaldata elettricamente a 1100K. Producono radiazioni a intensità inferiore al filamento di Nernst e alla Globar, ma sono più resistenti.

7500 @ Blackbody (theoretical ot 900° C) B2, 10-3 w cm-2 .-- 1 -1 D Globar & Nernst glower 750- * Mantle 75.0 7.5- 0.75 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 Wavelength, um

Monocromatori

Componenti di un monocromatore

Fenditura d'entrata Elemento collimatore (lente o specchio) che rende parallelo il fascio di radiazioni Prisma o Reticolo a gradinata come elemento disperdente Elemento focalizzatore (lente o specchio) che riforma l'immagine della fenditura e la mette a fuoco su una superficie piana detta piano focale

F Focal plane - 21 B Entrance slit Collimating lens Prism λ2 Focusing lens Exit slit A ta

Tipi di monocromatore

Monocromatore a prisma di Bunsen - utilizzato in vecchi strumenti. Prisma come elemento disperdente (dispersione per rifrazione) Materiale prisma: UV-vis - quarzo IR - NaCl

Monocromatore a reticolo di Czerney-Turner - reticolo a gradinata come elemento disperdente (dispersione per diffrazione) nẴ = d(sin i + sin r) i - inddent angle of light beam f - reflective angle of light beam d - distance between lines b n - order of reflection B λ - wavelength 0 r

Contenitori del campione

UV - quarzo Visibile – quarzo - vetro – plastica ₿ Infrarosso - NaCl – AgCl - KBr Spacer Circular Window

Rivelatori

Scopo del rivelatore è convertire la risposta che giunge dal campione in un segnale misurabile. S = kP + kd S = segnale k = sensibilità del rivelatore P = potenza radiante che arriva al rivelatore dal campione kd = corrente di fondo

Common detectors

Rivelatori in UV-vis

In UV-vis si possono utilizzare: · fototubi e fotomoltiplicatori · fotodiodi Quando si applica un potenziale ad un cristallo di Si drogato, si ottengono 2 regioni: n - (ricca di e-); p + (ricca di buche). All'equilibrio non si ha alcun flusso netto di corrente, ma quando viene esposto alla luce, l'equilibrio è perturbato e si ha passaggio di corrente p region n region · array di fotodiodi Costituito da moltissimi fotodiodi (> 1000 fotodiodi) spaziati a intervalli regolari su un chip. Possono rilevare contemporaneamente molte l.

FOTOTUBO

E' realizzato inserendo due elettrodi in una ampolla sotto vuoto, con una finestra (in quarzo) per il passaggio della radiazione luminosa. Il catodo (elettrodo negativo) è rivestito di un materiale fotosensibile che liberi facilmente elettroni (come il cesio), e tra anodo e catodo viene applicata una d.d.p .. Ha prestazioni superiori alle celle fotovoltaiche e fotoconduttive.

FOTOMOLTIPLICATORE

E' una variante del fototubo, ma con un accorgimento per aumentarne notevolmente la sensibilità. Vi sono infatti una serie di elettrodi (dinodi) contrapposti, in opportuno materiale, ai quali vengono applicati potenziali crescenti. In questa maniera gli elettroni vengono accelerati da un dinodo all'altro e ad ogni urto liberano più elettroni, moltiplicando così gli effetti finali (con amplificazioni dell'ordine 106 - 109). Sono quindi molto sensibili (e costosi). hv (radiazione) + hv (radiazione FFI 00000

Rivelatori IR

I rivelatori più semplici per IR sono: · termocoppie e termistori che sono sensibili a variazioni di T

Termocoppie

costituite da una coppia di giunzioni tra due metalli diversi. Tra le due giunzioni si instaura una ddp che dipende dalla differenza di temperatura.

Termistori

resistenze che cambiano al variare della temperatura thermistor or thermocouple mirror focusing mirror -sit

Tipi di Spettrofotometro

Esistono diversi tipi di spettrofotometro: · spettrofotometri monoraggio · spettrofotometri a doppio raggio · spettrofotometri multicanale (solo UV-visibile)

Spettrofotometri monoraggio

Gli spettrofotometri monoraggio, sono usati prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimento. La difficoltà nell'ottenere uno spettro sta nel fatto che per ogni misura ad ogni l si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco, oppure registrare prima lo spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo (procedura che può risultare macchinosa).

Spettrofotometri a doppio raggio

Negli spettrofotometri a doppio raggio, si ha invece un sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente a qualsiasi l senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro. Per questo motivo il doppio raggio è preferito per le applicazioni qualitative sia in UV che in IR.

Spettrofotometri multicanale

Negli spettrofotometri multicanale, un array di fotodiodi è in grado di rilevare contemporaneamente un ampio range di I. La risoluzione non è molto elevata e dell'ordine di 1 nn., è però in grado di effettuare un intero spettro in meno di 1 s.

0Single beam spectrophotometer Double beam spectrophotometer 3 2 4 5 6 1 - light source 4 - sample cell 2 - wavelength selector 5 - detector 3 - shutter 6 - readout DB in time. recombining mirror S detector source À. selector ] chopper Double beam spectrophotometer Multichannel spectrophotometers Double beam in space. bear splitter photodiode array

Aspetti sperimentali

Lampada D2 (UV) Reticolo di diffrazione Specchio 1 Fenditura 1 Fenditura 2 Lampada W (Vis) Filtro Specchio 4 Lente 2 Riferimento Rivelatore2 Io Specchio rotante Specchio 2 Campione Lente 1 A Rivelatore 1 I Specchio 3 Schema di uno spettrofotometro

O O varian@ Light Source Mirror UV Lamp Visible Light Lamp Premonochromator Second Monochromator σ Adjustable Slits Sample and Reference - Second Chopper First Chopper Photo Multiplier http://scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=UV-Visible_Spectroscopy http://www.varianinc.com/image/vimage/docs/products/spectr/uv/brochure/1942.pd

Processi di rilassamento

Stati eccitati S. n A = Assorbimento F = Fluorescenza P = Fosforescenza S = stato di singoletto S2 2 IC T = stato di tripletto IC = conversione interna ISC = intersystem crossing SI ISC 1 T 2 IC 3 A F IC T1 1 P S 20 Cortesia Prof Foggi - LENS Energia

Applicazioni alle proteine

Zone di assorbimento diverse · 10-185 nm UV di vuoto · 185-200 nm UV (legame peptidico) · 200-300 nm UV medio (amino acidi aromatici aromatici) · 300-400 nm vicino UV (gruppo eme) · 400-700 nm VIS (gruppo eme) · 700-2000 nm vicino IR (trasf.di carica) 00 Cortesia Prof Foggi - LENS

SPETTROSCOPIA UV-VIS IN SISTEMI PROTEICI

8 6 i ß Sheet 8 × 10-3 Random coil 4 - & Helix 2 190 210 230 25 2. (nm) Effetto del pH su una catena di poli-Lisina R H 1.32 Å C N O 1.23 Å R' 4 160 190 165 n p s Schema delle transizioni elettroniche del cromoforo amidico Cortesia Prof Foggi - LENS * S* * 210

Aminoacidi aromatici

Transizioni più intense Transizioni p p* di più bassa frequenza Fluorescenza delle proteine TRIPTOFANO TIROSINA FENILALANINA -30000 € (M-1 cm-1) -20000 10000 290 275 260 245 230 215 200 nm Cortesia Prof Foggi - LENS 0

Fluorescenza degli aminoacidi aromatici

La fluorescenza degli aminoacidi aromatici è molto sensibile alla polarità dell'intorno. Resa quantica (ovvero il rapporto fra fotoni assorbiti ed emessi) aumenta nei cromofori non esposti al solvente polare (acqua) Il massimo dell'emissione può cambiare. Ad esempio un triptofano in acqua emette a 350 nm mentre un triptofano ben protetto dalla proteina emette a 330 nm. 1,5 TIROSINA 1,0 INTENSITA' (u.a.) TRIPTOFANO 0,5- FENILALANINA 0,0 200 250 300 350 400 450 500 LUNGHEZZE D'ONDA (nm) Spettri di emissione di fluorescenza degli aminoacidi aromatici in acqua Cortesia Prof Foggi - LENS