Recettori associati alle proteine G (GPCR): struttura e attivazione

Recettori associati alle proteine G (GPCR)

Biologia II 3 maggio
Sara Pasqualoni
Luca Modesti
Cecilia Merlini

I recettori associati alle proteine G sono una famiglia di proteine integrali, di membrana, multipasso.
La struttura presenta 7 alpha eliche transmembrana; l'estremità amminica è rivolta verso l'ambiente
extracellulare e, l'estremità carbossilica verso il citoplasma. In aggiunta, le alpha eliche vengono
numerate dalla N-terminale (1) alla C-terminale (7).
Il sito di legame per la molecola segnale, nonché la proteina G, è una porzione citoplasmatica che si
trova tra l'alpha elica 5 e 7.
I recettori sono associati a proteine G eterotrimeriche, pertanto sono costituite da 3 polipeptidi
associati: alpha, beta e gamma. Alpha e Gamma prende contatto con il recettore e possiede attività
GTPasica: idrolizza GTP a GDP.
I segnali recepiti dai recettori associati alle proteine G sono di tipo ormonale, di natura proteica e
lipidica. La riposta indotta è variegata e dipende dal tipo di recettore, dalla tipologia di proteina G
applicata e dalle proteine effettore che si trovano a valle della proteina G, che possono attivarle o
inibirle.

Famiglie di proteine G eterotrimeriche

Le proteine G eterotrimeriche si dividono in tre famiglie:

• GS (stimolano l'adenilato ciclasi)
• GI (inibiscono l'adenilato ciclasi)
• GQ (attivano la fosfolipasi C)
• + G12/13 che attiva le proteine Rho, associate alle integrine (richieste per il rimodellamento del
  citoscheletro)

Il processo parte da un segnale che, in seguito, viene recepito dal recettore, il quale attiva la proteina G
che, a sua volta, modula un enzima intracellulare detto EFFETTORE.

Bersagli principali: gli Effettori

I principali bersagli, quindi, sono gli EFFETTORI e si dividono in tre tipologie:

• Adenilato Ciclasi: enzimi con attività adenilato ciclasica; convertono l'ATP in AMP ciclico;
• Fosfolipasi C: enzimi responsabili della formazione dell'inositolo trifosfato e del diacilglicerolo;
• Canali ionici: in particolar modo quelli del calcio e del potassio;

Esperimenti con proteine chimeriche

Sono stati condotti esperimenti, che hanno portato alla produzione di proteine chimeriche, unendo
frammenti di diversi recettori dell'adrenalina. È risultato evidente che un recettore attiva e l'altro
inibisce l'adenilato ciclasi. Inoltre, si è visto che era la porzione di proteina compresa tra l'alpha elica 5
e 6 a stabilire che tipo di proteina G venisse attivata; se questa porzione di proteina, che separa le due
alfa eliche, proviene da un recettore associato ad una proteina G attivatrice, quest'ultimo attiva una
prima proteina G attivatrice. Se invece questo tratto proteico (tra l'alfa elica 5 e l'alfa elica 6) proviene
da un recettore che di suo attivava una proteina G inibitrice, allora il recettore chimerico farà lo stesso.Quindi, è questa porzione (tra l'alfa elica 5 e l'alfa elica 6) ad essere responsabile dell'interazione con
la proteina G. Pertanto, il recettore partecipa con questa porzione; invece, la proteina G interagisce con
il recettore tramite la subunità alfa.
Se l'enzima effettore è l'adenilato ciclasi, l'ATP della cellula viene convertito in AMP ciclico (secondo
messaggero, una piccola molecola citoplasmatica capace di far fluire all'interno della cellula un
messaggio che era esterno).
In una cellula priva di segnale, la proteina G eterochimerica è nella sua forma inattiva ed è associata
con la subunità alfa al GDP; una volta arrivato il segnale si lega al recettore, con la conseguenza che il
primo evento della traduzione del segnale consista nel cambiamento conformazionale del recettore,
che consente al segnale di superare la membrana plasmatica (perché unisce il legando e si modifica
nella sua porzione extracellulare, transmembrana e citoplasmatica). Quindi, il recettore (non unito al
ligando) avrà una porzione citoplasmatica diversa rispetto alla sua versione unita al ligando. Questo
cambiamento conformazionale, che avverrà soprattutto nella porzione di proteina compresa tra l'alfa
elica 5 e l'alfa elica 6, consentirà di reclutare la proteina G eterochimerica quando il ligando é presente.
A questo punto la proteina G rilascia il GDP e lega il GTP, diventando così una proteina attiva; in seguito,
la subunità alfa si separa dalle subunità beta e gamma. In particolare, la subunità alfa (separata) si
muove lungo la membrana e va a interagire con l'enzima adenilato ciclasi, l'effettore. Tutto ciò porta a
un cambiamento conformazionale, motivo per cui l'effettore diventa attivo e comincia a prendere ATP
e a convertirlo in AMP ciclico; questa modifica conformazionale ha determinato l'idrolisi del GDP a GTP
e quindi ha spento la subunità alfa, che perde di affinità per l'effettore e torna ad associarsi alla
subunità beta e gemma.

Processo di attivazione della proteina G

Quindi, ripetendo:

1. il ligando si lega al recettore, cambiamento conformazionale
2. la proteina G, che era spenta, scambia il GDP con il GTP e diventa attiva
3. la subunita alfa si separa da quelle beta e gamma
4. la subunità alfa viaggia lungo la membrana e arriva a interagire con una proteina effettore, che
   in questo caso è l'adenilato ciclasi
5. la proteina effettore cambia conformazione e diventa attiva, producendo AMP ciclico
6. questo cambiamento conformazionale induce nella subunità alfa l'idrolisi del GTP a GDP
7. a questo punto la proteina G si è spenta, perde affinità con l'effettore e torna ad associarsi con
   beta e gamma.

L'adenilato ciclasi è una proteina di vaste dimensioni, con 12 alfa eliche. Una volta che l'ATP è presente
nella cellula, si comporta da secondo messaggero e l'AMP ciclico si lega ad una proteinchinasi, la PKA
(proteinchinasi AMP ciclico dipendente) e l'attiva.
L'AMP ciclico attiva la PKA perché quest'ultima ha una struttura quaternaria, costituita da due subunità
catalitiche e due subunità regolatrici, le quali non consentono di funzionare alle subunità catalitiche.
Nel momento in cui c'è AMP ciclico, le subunità catalitiche si liberano da quelle regolatrici e cominciano
a fare il loro compito, ovvero fosforilare. La PKA potrebbe fosforilare tutte le proteine della cellula, in
quanto è una chinasi che ha poca specificità di substrato; la cellula orienta l'attività della PKA in modo
preciso, utilizzando cellule che, nel corso del loro differenziamento, esprimono proteine della famiglia
delle AKAP (sta per "proteine che ancorano la PKA").

Risposta alla paura e adrenalina

Un ulteriore esempio potrebbe essere il fatto che quando si ha paura, si corre più velocemente. Alla
base di questo fenomeno c'è una spiegazione molecolare.
La risposta sta nei recettori localizzati sulla proteina G, i quali scaricano adrenalina, che a sua volta
scarica delle risposte a livello delle varie cellule, aumentando la frequenza cardiaca (e quindi velocizza
il circolo sanguigno) e aumenta la frequenza respiratoria (quindi si fornisce più ossigeno alle cellule,
per produrre ATP e quindi energia per scappare).

Risposte determinate dall'aumento di cAMP

Sono quelle risposte che hanno come effettore l'attivazione dell'adenilato ciclasi. I target cellulari sono
differenti, quindi a seconda del tipo cellulare la risposta della PKA è stata orientata in modo diverso e
specifico.
È vero che quando si ha paura si corre più velocemente oppure si ha maggiore forza per combattere? Il topo
quando incontrerà il gatto correrà più o meno velocemente, rispetto a quando è tranquillo nella campagna?
Il topo correrà più velocemente. Questo evento ha una spiegazione a livello fisiologico e molecolare correlata
ai recettori per proteine G.
La paura induce la secrezione di adrenalina nel corpo, questo ormone causerà:

• aumento della frequenza cardiaca
• aumento della respirazione, più ossigeno alle cellule per produrre più ATP
• muscoli scheletrici e cellule del fegato aumentano la demolizione del glicogeno per estrarre glucosio,
  questo sempre per produrre più ATP
• le cellule adipose aumentano la demolizione di trigliceridi per produrre ulteriore ATP
• l'intestino aumenta la secrezione di fluidi

L'adrenalina fa si che le nostre cellule producano più ATP, ma cosa avviene nel passaggio dall'adrenalina alla
risposta cellulare?
C'è un recettore per l'adrenalina in membrana che attiva la proteina G, che a sua volta attiva l'adenilato ciclasi
che andrà a produrre cAMP. Quest'ultimo, come abbiamo già ripetuto più volte, attiverà una PKA.

Trasduzione del segnale nelle cellule del fegato

Nelle cellule del fegato, adrenalina e glucagone attivano un recettore
associato a proteina G, questa poi, sempre attraverso gli stessi
meccanismi, attiverà la PKA.
Questa PKA attivata fosforila un enzima, la glicogeno-sintetasi, per inibirla.
Questo accade perché la glicogeno-sintetasi è l'enzima che catalizza
l'impacchettamento di glucosio in glicogeno quindi, in condizioni di
necessità di glucosio l'enzima viene inibito per inibire la formazione di
glicogeno. In questo modo aumento la disponibilità di glucosio libero e
l'arresto dell'impacchettamento in glicogeno.

Glucagone
Recettore
Adeniato
ciclasi
inattiva
Proteina G.
inattiva
GOP
Subunità G
ativa
Recettore
Ciciasi
XXX
GDP
ATP
AMP
Citoplasma
Protein-chinasi A
inactiva
Protein-chinasi A

La stessa PKA, tuttavia, fosforila un'altra proteina che si chiama fosforilasi-chinasi convertendola
ad una forma attiva. In questo modo, l'enzima fosforilasi-chinasi attiva fosforilerà un altro
enzima, la glicogeno-fosforilasi.
Quest'ultimo enzima è fondamentale perché il glucosio, conservato nel
glicogeno, per essere estratto, deve essere fosforilato in posizione 1. Il
glucosio-1-fosfato viene poi convertito in glucosio-6-fosfato che è pronto per
fuoriuscire dalla cellula.

ATP
ADP
P
Glicogeno
sintetasi
attiva
Glicogeno
sintetasi
inattiva
F
ATP
ADP
Fosforası
chinasi
attiva
P
ATP
ADP
Fosforilasi
chinasi
inattiva
P
Glicogeno
fosforilasi
inattiva
Glicogeno
fosforilasi
attiva

Tuttavia, la PKA fosforila anche una terza proteina, la KREB. Quest'ultimo è un fattore di trascrizione
che va a regolare positivamente i geni coinvolti nella gluconeogenesi, ovvero la capacità delle
cellule di produrre glucosio.
Possiamo concludere che le cellule, per aumentare la disponibilità di glucosio, agiscono:

• inibendo la sintesi di glicogeno
• demolendo il glicogeno conservato per liberare glucosio
• attivando la gluconeogenesi

La cellula, quindi, sta lavorando su tre livelli differenti utilizzando la via dell'adenilato
ciclasi e della PKA. Risulta quindi che la stessa PKA ha tre target differenti che hanno,
però, come unico obiettivo quello di aumentare la disponibilità di glucosio.
Questa pathway dell'adenilato ciclasi consente alla cellula di amplificare il segnale
all'interno del citoplasma in quanto, una sola molecola di adrenalina indurrà
l'attivazione di diverse proteine G eterotrimeriche. Queste proteine G andranno ad
attivare, ognuna, la propria adenilato ciclasi che produrrà molteplici molecole di cAMP
che a loro volta attiveranno molteplici PKA. Per questo motivo si parla di amplificazione
del segnale.

Adrenalina
1 molecola
Complesso
1 molecola
adrenalina-recettore
Epatocita
10 molecole
ATP
+ AMP ciclico
ademaisl
200 molecole
PKA inattiva
PKA attiva
100 molecole
Fosforilasi
chinasi b
inattiva
Fosforilasi
chinasi
attiva
1000 molecole
Glicogeno
fosforilasi h
inattiva
Glicogeno
fosforilasi o attiva
10 000 molecole
Glicogeno
+ Glucosio-1-fosfato
100 000 molecole
1
Glucosio
1
Glucosio ematico
100 000 molecole

Meccanismi di spegnimento del pathway trasduzionale

Il fatto che la cellula sappia recepire un segnale deve, necessariamente, implicare una capacità, della cellula,
di tornare allo stato di quiete. Questo deve avvenire affinché la cellula possa percepire una nuova variazione
nell'ambiente circostante. Se la cellula non tornasse mai allo stato di quiete non sarebbe in grado di percepire
degli stimoli successivi.
Ci sono dei meccanismi che permettono di spegnere la trasduzione del segnale. Di questi ne possiamo
descrivere alcuni intrinseci ed altri estrinseci.

Nucleo
ATP
ADP
P
CREB
CREB
P
CREB
CREB
CRE
Sintesi degli enzimi
della gluconeogenesi