Chimica organica, biochimica e biotecnologie: terapie e applicazioni

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Valitutti, Taddei, Maga, Macario Carbonio, metabolismo, biotech Chimica organica, biochimica e biotecnologie ZANICHELLI

Capitolo B5

Manipolare il genoma: le biotecnologie

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Che cosa sono le biotecnologie

Le biotecnologie sono applicazioni tecnologiche che utilizzano organismi viventi o loro derivati per realizzare prodotti e processi per usi specifici. Biotecnologie moderne usano la tecnologia del DNA ricombinante, che agisce sul genotipo degli organismi per ottenere nuovi fenotipi utili.

Applicazioni delle biotecnologie

• Green Biotech Monitoraggio ambientale Resa delle colture Prevenzione degli inquinamenti Biorisanamento
• White Biotech Antibiotici Amminoacidi e proteine Green chemistry
• Red Biotech Diagnosi Terapie Vaccini

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Le origini delle biotecnologie

Gli esseri umani hanno da sempre utilizzato gli organismi viventi a proprio vantaggio, spesso modificandone anche la struttura genetica. fermentazioni, domesticazione di piante e animali Il mais attuale (a destra) è stato ottenuto dagli antichi agricoltori dell'America centrale dal teosinte (a sinistra), una varietà di mais selvatico, per selezione progressiva dei semi con le caratteristiche desiderate. Collezione di semi di mais attualmente coltivati. L'ultimo a destra è un seme di teosinte. 0 A B Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 5

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I vantaggi delle biotecnologie moderne

Le biotecnologie moderne offrono numerosi vantaggi.

1. Le tecniche di ingegneria genetica sono più efficaci perché consentono di trasferire solo i geni desiderati
2. I geni trasferiti possono provenire da specie anche molto distanti dal punto di vista evolutivo rispetto alla specie ricevente: si generano così varietà impossibili da ottenere con gli incroci tradizionali
3. Le moderne biotecnologie agiscono in modo mirato e permettono di ottenere le caratteristiche desiderate con un'alterazione genetica minima, spesso limitata a un singolo gene (o a una parte di esso) tra le migliaia che compongono il genoma

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Il clonaggio genico

Il clonaggio genico permette di ottenere milioni di copie del gene di interesse.

1. Il gene di interesse viene separato dagli altri geni dell'organismo di partenza
2. Il gene viene inserito all'interno di una molecola di DNA plasmidico modificata, (vettore di clonaggio).
3. Il DNA ricombinante viene inserito all'interno della cellula ospite
4. Si isolano le cellule che hanno incorporato il plasmide
5. Il vettore si replica all'interno della cellula trasformata

DNA campione DNA genomico frammentato con un enzima Miscela dei frammenti con il DNA plasmidico tagliato con lo stesso enzima vettore di clonaggio Aggiunta di un enzima per unire i frammenti .C C O. Molecole di DNA ricombinante Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 7

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Tagliare il DNA con gli enzimi di restrizione

Endonucleasi di restrizione separano un frammento dalla molecola di DNA che lo contiene in corrispondenza di una specifica sequenza bersaglio. La doppia elica viene spezzata in due frammenti, ciascuno con un'estremità a singolo filamento. 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' 5'-G-3' 3'-CTTAA-5' 5'-AATTC-3' 3'-G-5' L'estremità terminale di ogni filamento è complementare a quella dell'altro. Gli enzimi endonucleasi come EcoRI producono delle estremità coesive (chiamate sticky ends in inglese) che sono molto utili per il clonaggio. Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 8

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Saldare il DNA con la DNA ligasi

DNA ligasi ricostituisce il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti CGATCCAGG GCTAGGTCCTTAA AATTCATCCAGCC GTAGGTCGG AGGCTCTAG TCCGAGATCTTAA AATTCTTCTAGCT GAAGATCGA DNA ricombinante 2. I due frammenti del DNA hanno appendici di basi non appaiate, che costituiscono «estremità coesive». CGATCCAGGAATTCTTCTAGCT GCTAGGTCCTTAAGAAGATCGA 3. Le estremità coesive possono unirsi con estremità coesive complementari derivanti da altri DNA; il DNA ricombinante che ne risulta può essere saldato dall'azione della DNA ligasi. CGATCCAGGAATTCATCCAGCC GCTAGGTCCTTAAGTAGGTCGG AGGCTCTAGAATTCTTCTAGCT TCCGAGATCTTAAGAAGATCGA 4. Solo una piccola frazione dei prodotti è ricombinante. La reazione più comune è la riunione spontanea dei DNA originali. Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 9

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I vettori di espressione

Organismo geneticamente modificato o OGM esprime un gene che deriva da un altro organismo Per raggiungere questo scopo si usano dei vettori plasmidici particolari: i vettori di espressione consentono di fare esprimere il gene clonato al loro interno in una qualsiasi cellula ricevente. Sito unico di restrizione Gene esogeno RT P R T P Trasformazione di E. coli Vettore di espressione Segnali per l'espressione di E. coli: P - promotore R - sito di legame al ribosoma T - terminatore P R T mRNA Cellula Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 10

Proteina ricombinante

La reazione a catena della polimerasi o PCR

La PCR permette di ottenere milioni di copie della sequenza genica originaria partendo da un frammento di DNA.

1. Denaturazione. Una molecola di DNA contenente una sequenza che si desidera copiare viene riscaldata a 90 ℃ per separare i filamenti di DNA.
2. Ibridazione. Quando la miscela si raffredda, i primer artificiali si associano al DNA a filamento singolo.
3. Allungamento. I nucleotidi trifosfato e la Taq polimerasi consentono la sintesi di due nuovi filamenti di DNA.
4. Grazie alla ripetizione del processo, in poco tempo si possono ottenere milioni di copie del DNA originale.

- nucleotide 5 3' 3' - 5' DNA originale da replicare 5 3' 1 5' 3' 1 1 5' 3' 1 denaturazione 2 ibridazione 3 allungamento 2 2 3' 5' 3 3' 5' - primer 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3 CHMONELLIL'impronta genetica

Ogni individuo contiene un'informazione genetica unica e individui diversi presentano minime ma significative differenze di sequenza. Queste differenze permettono di stabilire se due campioni di DNA appartengono allo stesso individuo oppure no. In particolare, nella genetica forense si utilizzano: ·l'analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione (RFLP, dall'inglese Restriction Fragment Length Polymorphism) ·l'impronta genetica o DNA fingerprinting Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 12

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La produzione biotecnologica di farmaci

E possibile inserire il gene per una proteina in cellule facili da coltivare, come i batteri (bioreattori); l'apparato metabolico cellulare permette poi di sintetizzarla a costi minori e con un impatto ambientale più ridotto. Talvolta si usano piante o animali, che hanno un apparato per la sintesi e la modificazione post-traduzionale delle proteine molto più simile a quello umano rispetto ai batteri. Alcuni farmaci ottenuti con le biotecnologie: ·insulina e altri ormoni ·fattori per la coagulazione ·anticorpi e vaccini Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 13

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I modelli animali transgenici

Le biotecnologie permettono di generare modelli animali transgenici per lo studio delle malattie umane, incorporando i geni che causano le malattie oppure eliminando il gene che esprime un certo carattere. Gene desiderato Marcatore selezionabile - Il gene desiderato viene inserito in un vettore lineare con un gene marcatore selezionabile, come quello per la resistenza a un antibiotico. Selezione dei trasformanti in terreno con antibiotico Isolamento e analisi del DNA di singoli trasfor- manti per verificare la correttezza dell'evento di inserzione Iniezione delle cellule ES trasformate in una blastocisti di topo Impianto della blastocisti iniettata in una femmina di topo La progenie chimerica ha cellule che discendono dalle cellule ES (pelo marrone) e dalla blastocisti (pelo bianco) Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 14

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La terapia genica

Grazie alle biotecnologie, oggi è possibile sostituire un gene non funzionale con la sua copia corretta. ADA cellula staminale con gene ADA funzionante 3. Il vettore retrovirale infetta le cellule e inserisce al loro interno la copia funzionante del gene ADA. 4. Le cellule che hanno acquisito il gene ADA funzionante sono reinfuse nel paziente, dove svolgeranno l'attività che prima non erano in grado di svolgere. gene ADA funzionante cellula del midollo osseo con gene ADA mutato V 2. Un retrovirus è ingegnerizzato attraverso l'inserzione della copia corretta del gene ADA. 1. Da un paziente sono estratte le cellule del midollo osseo, che presentano la copia non funzionante del gene per l'enzima ADA. vettore retrovirale Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 15

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Le terapie con le cellule staminali

Nelle prime fasi dello sviluppo l'embrione è formato da cellule non differenziate: sono le cellule staminali. Esistono diversi tipi di cellule staminali: ·cellule staminali totipotenti in grado di dare origine a tutti i tipi cellulari e quindi, potenzialmente, a un intero organismo ·cellule staminali pluripotenti possono differenziarsi in uno dei tre foglietti embrionali (mesoderma, ectoderma ed endoderma) ma non possono generare un intero individuo ·cellule staminali multipotenti generano un limitato numero di tipi cellulari (come le cellule staminali ematopoietiche, che producono le cellule del sangue) Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 16

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Le terapie con le cellule staminali pluripotenti indotte

È possibile, almeno in teoria, avere a disposizione una riserva per differenziare diversi tipi di cellule o addirittura interi organi. Tuttavia esistono le cellule staminali embrionali umane (pluripotenti) possono essere prodotte solo generando in vitro embrioni umani, una procedura che pone importanti questioni di ordine etico. Le biotecnologie offrono un soluzione a questi problemi, permettendo di generare un terzo tipo di cellule staminali, dette staminali pluripotenti indotte (iPSC, induced Pluripotent Stem Cells) che si ottengono dalla riprogrammazione di cellule adulte già differenziate. Valitutti et al., Chimica organica, biochimica e biotecnologie @ Zanichelli editore 2020 17