Immunoterapia dei tumori: approcci attivi e passivi, cellule CAR-T

Immunoterapia dei tumori

Lezione 12 Prof. Roberto Bei Immunoterapia dei tumori Domande esame > modalità di produzione delle proteine ricombinanti, vaccini virali, che cosa è un antigene tumore associato, che cosa è un antigene tumorale in generale, qual è la teoria di Kotz, come si rileva la risposta immunitaria nei confronti degli antigeni tumorali, come si costruiscono i vaccini, l'essudato. Le cellule tumorali esprimono degli antigeni. Gli antigeni li abbiamo definiti come antigeni specifici, in cui abbiamo un'espressione "olatitativa" differente tra le cellule normali e quelle neoplastiche, e gli antigeni tumore associati, in cui la differenza è di tipo quantitativo, ossia le cellule tumorali si esprimono in una più elevata quantità di antigene rispetto alla controparte neoplastica. La maggior parte di questi antigeni sono antigeni oncofetali, antigeni di differenziazione e questi antigeni vengono utilizzati come bersagli in approcci di immunoterapia, che può essere attiva o passiva.

• Immunoterapia attiva > immunizziamo i pazienti con l'antigene e induciamo nel paziente una risposta immunitaria in grado di riconoscere l'antigene espresso dalle cellule tumorali e auspichiamo che questa risposta immunitaria sia talmente potente da indurre l'arresto della crescita delle cellule tumorali e la loro eliminazione.
• Immunoterapia passiva > somministrazione di componenti già preformati nel sistema immunitario in grado di riconoscere l'antigene, e quindi si possono iniettare nel paziente i linfociti T citotossici educati a riconoscere l'antigene, oppure possiamo iniettare nel paziente anticorpi monoclonali umanizzati preformati, in grado di riconoscere quel particolare antigene.

L'immunoterapia attiva ha un vantaggio rispetto a quella passiva, ovvero che il paziente ha la memoria di aver incontrato quell'antigene e quindi non è necessario somministrare continuamente componenti del sistema immunitario, come nell'immunoterapia passiva. Ma due o tre vaccinazioni con l'antigene permettono di espandere tutti i linfociti già preesistenti in grado di riconoscere quel determinato antigene. Abbiamo detto che questo è un requisito fondamentale: la presenza di linfociti CD4 e CD8 che sono in grado di produrre anticorpi che riconoscono l'antigene, altrimenti non avrebbe senso somministrare un antigene all'esterno se non fossero già presenti linfociti autoreattivi. IMPORTANTE > si parla di linfociti autoreattivi perché la maggior parte di questi antigeni sono antigeni self, per cui è auspicabile che la tolleranza Tumor antigen Active 1 immunitaria non abbia funzionato in APC maniera adeguata nei confronti degli Peptide MHC Class II antigeni self, e il mancato funzionamento Antibodies della tolleranza immunitaria ha fatto si che CD4+ 5 T cells nel repertorio di quel paziente ci siano linfociti autoreattivi. B-cell Passive Cancer- Immunotherapy 8 CTL Tumor Cell Cytokines IL-1, IL-6, TNFa, IL-2, IFNy, IL-4, GM-CSF Granulocyte 6 ADCC NK cell Quello che si vuole ottenere quando abbiamo come bersagli degli antigeni tumore associati, quindi attraverso la loro CDC somministrazione, è l'induzione di una Complement lysis patologia autoreattiva: per esempio nel melanoma, quando i pazienti portatori di melanoma sono stati vaccinati contro questo tumore, gli sono stati somministrati gli antigeni espressi dal melanoma, ma anche dai melanociti. Quindi è avvenuta l'eliminazione del melanoma, ma i pazienti come effetto avverso hanno manifestato la vitiligine, perché gli anticorpi prodotti nei confronti dell'antigene tumore associato, erano in grado di riconoscere l'antigene espresso dal melanoma, ma anche dai melanociti, cellule normali. Quindi è chiaro che nei pazienti oncologici ci sono degli anticorpi in grado di riconoscere gli antigeni espressi dalle cellule tumorali di cui il paziente èportatore. Nei pazienti oncologici ci sono linfociti che sono in grado di riconoscere le cellule tumorali che presentano quel particolare antigene, nonostante quell'antigene sia self. Il problema non è che non c'è la risposta immunitaria, perché questa può essere rilevata, ma la questione si sposta sulla capacità della risposta immunitaria di essere forte ed efficiente, ovvero questa risposta immunitaria è così potente da eliminare le cellule tumorali? Probabilmente lo è nello sviluppo iniziale del tumore, ma successivamente il tumore prende il sopravvento, non lo sapremo mai, possiamo solo sapere se c'è la risposta immunitaria. Per fare questo andiamo ad analizzare la presenza di anticorpi nel siero andando a verificare se nel sangue di quel paziente ci sono dei linfociti in grado di riconoscere le cellule tumorali che portano l'antigene. Ma sappiamo anche che, la risposta immunitaria, quando è presente, probabilmente non è efficiente perché le cellule immunitaria sopprimono tale risposta, quindi è presente ma è contenuta perché nel microambiente tumorale si crea una serie di cellule immunoregolatori, come le cellule T-reg, che sopprimono la risposta immunitaria anche se è presente. Nel microambiente tumorale ci sono delle cellule APC immature che non sono efficienti nel meccanismo di presentazione dell'antigene e contribuiscono alla creazione delle cellule T regolatorie, che inibiscono la risposta immunitaria. Senza dubbio al di là di questo ambiente, che è immunosoppressorio per la produzione di ROS, per la produzione di ossido nitrico, per il rilascio dell'arginasi che determina la riduzione dell'arginina, per la presenza delle prostaglandine, per la presenza della chinurenina, per tutta una serie di meccanismi, nonostante che questo sia presenta, e nonostante che gli antigeni siano self, è comunque vero che c'è una risposta immunitaria spontanea nei pazienti oncologici. E abbiamo anche detto il perche: gli antigeni tumore associati che inducono una risposta immunitaria sono antigeni particolari, perché non hanno una conformazione stabile, non si legano in maniera stabile al complesso maggiore di istocompatibilità, e quindi quando vengono presentati a livello dei linfociti non li riconoscono. Siamo in grado di rilevare la presenza di questa risposta immunitaria? Si. La possiamo individuare attraverso il dosaggio degli anticorpi che riconoscono gli antigeni attraverso l'analisi dei linfociti che riconoscono le cellule tumorali che presentano l'antigene. Abbiamo due approcci per quanto riguarda la risposta umorale:

Approccio SEREX

Approccio SEREX > permette di fare un'analisi sierologica: si deve essere in possesso del siero del paziente che porta il tumore e si svolge un'analisi della reattività di questo siero nei confronti di una libreria che esprime tutti gli antigeni tumore associati. Quindi dobbiamo usare due strumenti, una libreria di espressione dell'antigene e il siero del paziente. Di fatto l'espressione si crea utilizzando dei fagi che infettano i batteri che esprimeranno l'antigene e questo fa si che si possa creare una libreria di espressione a cDNA, che si ottiene a partire da un tumore: si prende il tumore da un paziente, si estrae il cDNA e facciamo una libreria di espressione di cDNA di tutti gli antigeni espressi da quelle cellule tumorali. Poi si mettono in un fago, il fago infetta il batterio e il batterio esprimerà un antigene. Quindi si crea quella libreria di espressione. Ogni colonia di batteri cresce come puntini su una piastra di agar. Ogni batterio esprime un antigene, che può essere tumore associato, tumore specifico, una proteina anormale. Tutti derivano dal cDNA che abbiamo estratto dal tumore del paziente. Quindi quando si ha l'agar dove crescono i batteri in colonie, si prende un foglio di nitrocellulosa, si mette sopra e si fa una replica: ogni colonia di batteri viene trasferita sul filtro e ognuna esprimerà un determinato antigene o proteina. Dopo di che si fa una reazione antigene-anticorpo: si prende il siero del paziente, si diluisce e si fa reagire con il foglio di nitrocellulosa. Poi si prende un anticorpo secondario che riconosce l'anticorpo primario che si è legato all'antigene e quindi sono in grado di riconoscere il coniugato dell'anticorpo. Quando si vede la reattività del siero si trovano tre spot, ma cosa vogliono dire? Significa che il siero del paziente contiene anticorpi che riconoscono tre antigeni espressi da quei batteri. A questo punto dal filtro torno indietro e dalla replica sul filtro individuo qual è la colonia di batteri che aveva l'antigene che si è legato e la espando ed estraggo il cDNA e lo sequenzio. In questo modo identifico la sequenza di DNA che codifica per l'antigene che è riconosciuto dall'anticorpo. In questo modo si identificano gli antigeni immunogenici. Questa è la teoria perché in realtà, quando si mette il siero del paziente, si vede che si appiccica da tutte le parte, ci sono tanti spot e alcuni sono irrilevanti per l'espressione di un antigene perché, quando si va a sequenziare non ha nessun senso. La teoria è questa: se c'è un anticorpo nel siero del paziente che riconosce un antigene e avete espresso quell'antigene tramite i batteri con una libreria cDNA viene identificata in questo modo. Questo in generale è un approccio che viene utilizzato per individuare nuovi antigeni immunogenici.

Immunologia inversa

L'altro approccio è l'immunologia inversa > che è molto più semplice e parte dal fatto che noi conosciamo quali sono gli antigeni. Questo approccio viene utilizzato per sapere se in un paziente ci sono anticorpi contro gli antigeni che noi conosciamo: noi sappiamo che CEA è iper-espresso nei tumori, così come l'alfafetoproteina, ERB2, e così via. Quello che si può fare, conoscendo gli antigeni tumore associati, è produrre una sorgente ricombinante di quell'antigene o comprarli da una company che purifica gli antigeni e andare ad analizzare la nostra corte di pazienti oncologici. Io analizzo 100 pazienti che hanno il tumore del colon e voglio sapere se questi 100 pazienti hanno una risposta immunitaria contro il CEA. Così vado ad analizzare la mia corte di pazienti grazie al solo western-blotting. Per esempio, uno studio condotto dal professore si è basato sullo studio della presenza di anticorpi contro l'alfafetoproteina in pazienti con epatocarcinoma e epatiti. L'alfafetoproteina è un antigene tumore associato, oncofetale, che è iper-espresso negli epatocarcinomi. Quindi hanno comprato l'alfafetoproteina, si è fatta elettroforesi, western-blotting e hanno analizzato il siero del paziente A n-AFP d-AFP 97- 97- 68- 1 1 68- MAb C3 MAb D612 P.4 P.6 P.9 N MAb MAb P.4 P. 03 D612 n-AFP d-AFP anti- anti- P.1 P.5 N anti- anti- AFP CD69 P.1 Z IP: AFP CD69 97- 68 - 1 1 BLOT: MAb C3 C d-AFP DG-AFP d-AFP DG-AFP d-AFP DG-AFP d-AFP DG-AFP d-AFP DG-AFP d-AFP DG-AFP 68- 1 MAb C3 MAb D612 P.3 P.10 P.11 N Nell'immagine 4-6-9 sono diversi pazienti di cui è stato analizzato il siero e si sono usati diversi approcci. Si voleva testare la seguente ipotesi: "alcuni antigeni tumore associati diventi immunogenici quando espongono degli epitopi criptici e non lo sono quando l'antigene ha conformazione tridimensionale". Si voleva testare questa ipotesi e si voleva vedere se l'alfafetoproteina induceva spontaneamente in pazienti con epatocarcinoma, una risposta immunitaria umorale e vedere che cosa riconoscevano gli anticorpi: un epitopo nativo o conformazionale o un epitopo denaturato o criptico. Per fare questo è molto semplice: si fanno de diversi tipi di gel: un gel nativo e un gel in condizioni denaturanti. Il buffer naturalmente è un buffer di loading nativo oppure si usa un buffer denaturante: per denaturare una proteina serve SDS-PAGE e beta mercapto etanolo. Questi rompono i ponti di solfuro e denaturano le proteine. Nella prima corsa si vede l'alfafetoproteina nella sua struttura nativa non denaturata e il peso molecolare varia perché la conformazione è diversa. Accanto c'è l'alfafetorpoteina denaturata e si vede che c'è un solo peso che di solito è intorno a 67/68. Nel paziente 4 gli anticorpi riconoscono la proteina denaturata e non la proteina nativa: l'anticorpo non si lega alla proteina non denaturata, ma il siero del paziente che contiene gli anticorpi, si lega alla proteina denaturata. Poi si sono chiesti: siccome l'alfafetoproteina è una glicoproteina, come facciamo a sapere se l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo è un epitopo proteico o glicidico? Deglicosiliamo la proteina. Ci sono degli enzimi V Z B