Crecimiento microbiano: fases y tipos de cultivo en Biología

Crecimiento microbiano

En microbiología el crecimiento se define como el incremento en el número de células.

DNA DNA replication Cell elongation Septum formation One generation Completion of septum with formation of distinct walls Cell separation

• La bipartición o fisión binaria es el proceso por el cual una célula se divide para formar dos células iguales.
• La formación de dos células a partir de una, se llama generación y el tiempo requerido para la división es el tiempo de generación o tiempo de duplicación.

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMFisión binaria Cell wall Plasma membrane 1 Cell elongates and DNA is replicated DNA (nuclear area) 2 Cell wall and plasma membrane begin to grow inward C DNA (nuclear area) Partially formed cross-wall 3 Cross-wall forms completely around divided DNA 1 Cell wall 4 Cells separate TEM 0.5 um (a) A diagram of the sequence of cell division. (b) A thin section of a cell of Bacillus licheniformis starting to divide.

Durante la fisión binaria cada célula recibe una copia del cromosoma, de los ribosomas, complejos macromoleculares, así como monómeros y iones inorgánicos para existir como una célula independiente.

El ADN se ancla a la membrana para que cada célula hija se quede con una copia, entonces se forma el septo que dará lugar a las dos células, para que posteriormente se separen.

Fisión binaria y separación celular

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMFisión binaria La formación de septo y la posterior separación celular difiere según el tipo de bacteria.

A B. subtilis E. coli C. crescentus Sidewall, then septum Sidewall, then septum + constriction Sidewall, then constriction only B S. pneumoniae S. aureus C. glutamicum 1 1 Septum + sidewall Septum only Tip growth, then septum Current Biology Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM Current Biology 19, R812 - R822 (2009)Crecimiento bacteriano A B L - L Current Biology

La presencia de proteínas específicas en los polos indica la orientación del crecimiento de las hifas.

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM Current Biology 19, R812 - R822 (2009)Divisoma

Las proteínas Fts (filamentous temperature sensitive) interactúan para formar el aparato de división o divisoma.

• FtsZ polimeriza y forma una anillo en el centro de la célula.
• FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para el ensamblaje de proteínas del divisoma.
• ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática.

Outer membrane Peptidoglycan ZipA Fts FtsA Cytoplasmic membrane FtsK ATP GTP GDP + P; ADP + Pi FtsZ ring Divisome proteins FtsZ ring Cytoplasmic membrane Division plane

• Ftsl es una proteína involucrada en la síntesis de peptidoglucano y es también llamada proteína de unión a penicilina (PBP) debido a que su actividad es bloqueada por el antibiótico.

Divisoma y replicación del ADN

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMDivisoma y la Replicación del ADN

La replicación del ADN ocurre previo a la formación del anillo FtsZ, este se forma en el espacio entre los cromosmas duplicados.

• MinC/MinD es un inhibidor de la división celular y evita que FtsZ ensamble el anillo lejos del centro.
• MinE inhibe la actividad de MinC y se ancla al centro de la división.
• FtsK participa en la segregación del genoma.
• FtsZ también tiene actividad de GTP hidrolasa, libera energía para la polimerización y despolimerización, así como para el ensamblaje y desensamblaje del anillo.

MipZ Origin FtsZ ParB Origin segregation Displacement of FtsZ Z-ring formation Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMProteína MreB y la forma de las bacterias

La presencia de la proteína MreB se ha relacionado con la forma bacilar de las bacterias.

Spatial separation of transcription and translation

• FtsZ tubulina bacteriana.
• MreB actina bacteriana.

Nucleoid RNA polymerase a Cytoplasm/ribosomes (protein synthesis) b Localization of the nucleoid and the DNA replication machinery oriC segregation complex Replisome Septosome (FtsZ-tubulin) C MinD Cytoskeleton proteins in cell divisions and morphogenesis DivIVA MreB filaments (actin) Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM Nature Cell Biology 5, 175 - 178 (2003)Forma de las bacterias MreB vs. FtsZ A MreB FtsZ T B MreB FtsZ V Current Biology Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMAutolisinas

Las enzimas autolisinas tienen una función similar a la lisozima, realizan pequeños orificios o poros por los que se van añadiendo los nuevos componentes celulares.

Las autolisinas forman parte del complejo divisoma.

La síntesis del nuevo peptidoglucano deja en la células Gram positivas una cicatriz.

La formación de poros y la síntesis debe ser coordinada para evitar la autolisis de la célula.

FtsZ ring Wall bands Growth zones Micro Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMBactoprenol y transpeptidación

El bactoprenol acarrea los precursores de la pared celular, en el periplasma interactúa con la enzima que inserta los precursores de pared celular y cataliza la formación del enlace glucosídico.

La transpeptidasa forma el enlace peptídico entre las cadenas de aminoácidos de las unidades de mureína.

CH3 CH3 CH3 H3C-C =CHCH2(CH2C=CHCH2)9CH2C =CHCH2 0 1 O=P-O- I O O=P-O- I [N-Acetylmuramic acid] -O Peptidoglycan Growing point of cell wall GMGM M M -G M GM- G - GM G M-G- M-G E -G M G Cytoplasmic membrane Out 5 P In Pentapeptide M G P -P Bactoprenol Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM G GCrecimiento exponencial

Time (h) Total number of cells Time (h) Total number of cells 0 1 4 256 (28) 0.5 2 4.5 512 (29) 1 4 5 1,024 (210) 1.5 8 5.5 2,048 (211) 2 16 6 4,096 (212) 2.5 32 · · 3 64 · 3.5 128 10 1,048,576 (219) 1000 1000 Logarithmic Arithmetic Number of cells (arithmetic scale) - 100 500 10 Number of cells (logarithmic scale) 100 1 0 1 2 3 4 5 Time (h)

Cuando un cultivo se duplica de manera regular durante un intervalo de tiempo, se denomina crecimiento exponencial.

Una gráfica aritmética del crecimiento muestra un incremento constante mientras que una logarítmica, permite calcular el tiempo de generación cuando el crecimiento es exponencial.

Tiempo de generación

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMTiempo de generación

Número de generaciones 2n Número total de células 0 2º 1 1 21 2 2 22 4 3 23 8 4 24 16 5 25 32 6 26 64

Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique.

G = t/n

En donde t es el tiempo total de incubación y n es el número de generaciones.

N = No2n N = No 2+/G lnN = lnNo + (t/G) ln2

Donde N es el número de células

Cálculo del tiempo de generación

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMTiempo de generación

Si u es igual a In2/G, en donde u es la velocidad de crecimiento específica, entonces la ecuación queda:

InN = InNo + ut y = mx + b

Si despejamos G de la ecuación queda:

t ln2 G = ln N - ln No

Tiempos de duplicación bacteriana

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMTiempos de duplicación

Bacteria Medio Tiempo de duplicación (minutos) Escherichia coli Glucosa-sales 17 Bacillus megaterium Sacarosa-sales 25 Streptococcus lactis Leche 26 Staphylococcus aureus Medio de infusión de 27-30 corazón Streptococcus lactis Medio con lactosa 48 Lactobacillus acidophilus Leche 66-87 Rhizobium japonicum Manitol-sales-extracto 344-461 de levadura Mycobacterium tuberculosis Medio definido 762-932 Treponema pallidum Testículos de conejo 1980 Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMCurva de crecimiento

Ln del número de microorganismos C D E B A Tiempo Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMCurva de crecimiento

• A (Fase Lag). Periodo de latencia o adaptación: no hay aumento significativo de la densidad celular, el crecimiento es asincrónico.
• B (Fase Log). Periodo de crecimiento exponencial, el crecimiento es sincrónico y se alcanza la máxima velocidad de crecimiento.
• C (Fase pre-estacionaria). Periodo de retardo, desaparece el crecimiento exponencial, los microorganismos entran en estrés. Se terminó el nutriente limitante.
• D (Fase estacionaria). Periodo estacionario: no hay cambios significativos de la densidad celular con respecto al tiempo, existe un equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos.
• E (Fase de muerte). Fase en la que el equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento.

Tipos de cultivo

Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMTipos de cultivo

• Cultivo en lote
• Cultivo en lote alimentado
• Cultivo en continuo

Substrate F, Sf Volume, V Substrate, S Product, P Cells, X Motor pH 4-pH controller Steam C Sterile seal 7 Viewing port Filter Exhaust O Impeller O Cooling water out Cooling jacket Baffle Culture broth Cooling water in 'o Sparger (high pressure air) Sterile air Steam - Valve Harvest Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM Acid-base reservoir and pump OTemperatura

Velocidad de crecimiento 1. Gelificación de la membrana; los procesos de transporte se llevan a cabo lentamente y no hay crecimiento. Óptimo 1 (3) (2) Mínimo Máximo (1) (4) Temperatura 2. Las reacciones enzimáticas aumentan su velocidad. 3. Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a su máxima velocidad. 4. Desnaturalización de proteínas y membrana citoplasmática. Lisis térmica. Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAMTemperatura

Thermophile Example: Bacillus stearothermophilus Hyperthermophile Hyperthermophile Example: Pyrolobus fumarii Mesophile 60° Example: Escherichia coli 88° 106° 39º Psychrophile Example: Polaromonas vacuolata 4º 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Psicrófilos Mesófilos Termofilos Hipertermófilos Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM Growth rate Example: Thermococcus celerTemperatura. Clasificación

Clasificación de microorganismos de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento

Psicrófilos 0 - 20℃ Flavobacterium sp. 13ºC Mesófilos 20 - 40℃ Escherichia coli 37ºC Termófilos 40 - 60℃ G. stearothermophylus 60℃ Hipertermófilos 60-80℃ Thermococcus celer Termófilos extremos > 80℃ Pyrodictium brockii

Psicotróficos: Microorganismos que crecen a temperatura ambiente pero causan contaminación en condiciones de refrigeración.

Termodúrico: Microorganismos mesófilos que soportan un tiempo la temperatura mayor a su óptima.