Lezione 1: Storia della biologia molecolare e meccanismi di riparazione del DNA

STORIA DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

• 1865 Mendel scopre il ruolo dell'ereditarietà, quindi introduce il concetto di gene; viene considerato il padre della genetica moderna, facendo degli esperimenti sulla pianta dei piselli.
• 1869 Miescher scopre il DNA, isolando una sostanza acida (dna), ricca di fosforo, dal nucleo di globuli bianchi prese da bende infette, che lui chiama nucleina.
• 1910 Levene propone il modello del tetranucleotide: dà il nome a questi composti di deossiribonucleico e acido ribonucleico e propone una struttura tetranucleotidica del DNA, che può essere lineare o ciclica, in cui le 4 basi sono presenti. Questo modello descrive il DNA come delle piccole molecole costituito da 4 nucleotidi, ma gli venne il sospetto che la molecola del DNA, essendo piccola, non potesse agire come molecola dell'eredità.

1930/1950 Ci sono altri esperimenti molto importanti che vengono fatti da: Griffith, Avary, Chase e Hershey, in cui vengono fatti esperimenti su organismi semplici su batteri/bateriofagi, dimostrando che il DNA è il materiale genetico

ESPERIMENTI DI GRIFFITH

Griffith, stava studiando la possibilità di fare un vaccino per combattere la polmonite (causata dal batterio streptococcus pneumoniae), e per questo studio lui stava utilizzando 2 ceppi di batteri:

• Ceppo benigno R (rugoso): benigno perché non è rivestito da una capsula protettiva, e quindi quando entra nell'organismo infetto, viene riconosciuta dal sistema immunitario e viene subito disattivato
• Ceppo virulento S (liscio): virulento perché è rivestito da una capsula liscia che lo protegge dal riconoscimento da parte del sistema immunitario causando la polmonite

Il ceppo R, viene iniettato nel topo e quest'ultimo vive; Il ceppo S, viene iniettato nel topo e quest'ultimo si ammala di polmonite e muore. Di seguito a questo esperimento, Griffith, prende il ceppo virulento, lo inattiva con il calore e diventa innocuo, e viene nuovamente iniettato nel topolino e vive; ma, quando i batteri del ceppo benigno, vengono mischiati con batteri del ceppo virulento inattivati e vengono iniettati nel topo vivo, succede che il topo contrae la polmonite e muore, PERCHÉ? Poiché, isolando i batteri del sangue dei topi deceduti, scoprì che i batteri del ceppo R, benigno, acquisisce la capsula mantenendo questa caratteristica per diverse generazioni; di seguito a questa dimostrazione, egli ipotizzò che ci fosse un agente chimico del ceppo S che andava a finire nel ceppo R trasformando quest'ultimo in un ceppo virulento. Questo agente chimico, Griffith lo definisce come: Principio trasformante: è in grado di trasferire le informazioni genetiche da un organismo ad un altro e quindi di trasformare i batteri non virulenti nella forma virulenta, questo agente chimico corrisponde al gene che codifica per la capsula poiché, quando i due ceppi di batteri sono stati mescolati, anche i DNA sono stati mescolati cioè, i geni del batterio S che codificata per la capsula sono andati a finire nel batterio R e quindi anche quest'ultimo era in grado di proteggersi da sistema immunitario grazie allo sviluppo della capsula.

ESPERIMENTO DI AVERY

Quando vennero fatti gli esperimenti di Griffith, non si sapeva quale fosse l'agente chimico del principio trasformante, e si ipotizzava che potesse essere uno dei 3 componenti più importanti della cellula (lipidi, carboidrati, DNA) poiché non si sapeva quali di questi fosse l'agente che trasferiva le informazioni genetiche. Partì da un ceppo di pneumococco S, facendo un estratto cellulare di questo batterio, purificarono le componenti molecolari di questo estratto separando tutti i componenti dell'estratto:

• Proteine
• RNA
• Lipidi
• Polisaccaridi
• DNA

e a tutte queste componenti vengono aggiunti gli pneumococchi R, NON VIRULENTI per determinare quale di questi causasse la trasformazione dell'agente patogeno; Si scoprì che sono il DNA era in grado di operare questa trasformazione; quindi, è il principio trasformante. Questo esperimento viene definito come 'la bomba di Avery', poiché la comunità scientifica, al tempo, pensava che il principio trasformante fossero causate dalle proteine, perché sono la parte operativa funzionale del nostro sistema, i caratteri come capelli o colore degli occhi si vedono con le proteine, e quindi la scoperta che l'agente del principio di trasformazione fosse il DNA arrivò prematura.

ESPERIMENTO CHASE E HERSHEY

Dimostrarono definitivamente che il DNA è il materiale genetico attraverso esperimento con un frullatore, utilizzando dei batteriofagi. (COSA SONO I BATTERIOFAGI? Sono dei virus che infetta i batteri e ha una capsula proteica dove all'interno c'è il materiale genetico. Quando un virus infetta un batterio, vi trasferisce il suo materiale genetico, mentre la capsula rimane fuori.) Chase e Hershey presero 2 batteriofagi e marcarono:

1. Il capside proteico lo marcarono con l'isotopo radioattivo dello zolfo, ZOLFO 32
2. Il DNA lo marcarono con l'isotopo di fosforo

Il virus, quando viene posto a contatto con il batterio, inserisce il materiale genetico all'interno della cellula batterica e il capside rimane fuori; a questo punto i virus vengono 'staccati' dalle cellule con il frullatore; quindi, la parte del capside viene eliminata e rimane soltanto il battere con il DNA all'interno; successivamente cellule batteriche e virus vengono separati per centrifugazione dimostrando che le proteine marcate con lo zolfo non si trovano nella cellula batterica, mentre il DNA che è marcato con fosforo si trovano nelle cellule batteriche. Questo esperimento dimostra appunto che l'agente patogeno responsabile della trasformazione è il DNA Nel 1953, nasce la biologia molecola dalla deduzione della struttura a doppia elica di Watson e Crick, ma questa deduzione deriva dagli esperimenti di Rosalind Franklin tramite la cristallografia a raggi X, grazie alla quale riuscì a fare delle foto del DNA e ipotizzò la struttura ripetitiva del DNA Dopo le scoperte sul DNA, gli scienziati non riuscirono a capire il collegamento tra GENOTIPO e FENOTIPO (dna/proteine); il dna è presente solo nel nucleo, mentre le proteine vengono sintetizzate sui ribosomi, nel citoplasma; quindi, bisognava cercare una molecola intermedia che potesse prendere queste informazioni dal nucleo e portarla fino al citoplasma, questa molecola intermedia è l'RNA, e si trova sia nel nucleo che nel citoplasma, in maniera più specifica, l'RNA messaggero (mRNA) che trasporta le informazioni dal DNA alle proteine. Una volta che l'informazione genetica si è 'infilata' nelle proteine, non può più uscirne, ciò significa che l'informazione genetica che è racchiusa nel DNA, viene trasportata attraverso un processo di trascrizione all'RNA messaggero sintetizzato nel nucleo, questo mRNA, le informazioni passano, tramite il processo di traduzione nei ribosomi e nel citoplasma, alle proteine. Questo flusso è mono direzionale.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

STRUTTURA CHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Il DNA, acido desossiribonucleico, è un composto organico che fa parte della famiglia degli acidi nucleici, inoltre è un polimero costituito da unità chiamate nucleotidi;

• che cos'è un polimero? È una catena di monomeri.

Nello specifico, il DNA, è un BIO-POLIMERO, cioè una catena prodotta da organismi viventi. Gli acidi nucleici, quindi DNA e RNA sono dei polinucleotidi, cioè sono dei polimeri costituiti da nucleotidi, ognuno di essi è formato da 3 componenti:

Purine Pirimidine NH2 NH2 O N H 7 5 N 7 N 3 2 2 1 H H 1 1 I Adenina (A) Guanina (G) Timina (T) Citosina (C) Uracile (U) 5 5 HO-CH2 OH HO-CH2 OH C O 4 4 3 2 3 2 OH OH OH Ribosio Deossiribosio Figura 2.1 Strutture dei componenti chimici degli acidi nucleici. H H CH3 N O 1 - Z HON N H H H

1. ZUCCHERO: formato da 5 atomi di Carbonio (pentosio), lo zucchero che sta alla base della molecola del DNA è il 2-deossi-D-ribosio/2-desossiribosio, la nomenclatura è così perché al 2' manca un gruppo ossidrile; nel caso di RNA, lo zucchero alla base è il ribosio, la nomenclatura indica che ha tutti i gruppi OH; questa differenza influenza drasticamente la funzione, poiché il gruppo OH del ribosio ha un grande ingombro sferico; quindi, rende difficile i legami tra i nucleotidi di RNA influenzando sia la stabilità poiché RNA è più instabile rispetto al DNA e ciò impedisce la formazione della doppia elica nel RNA, infatti esso ha un filamento singolo;
2. GRUPPI FOSFATI: conferisce al DNA e RNA, le proprietà di un acido a PH fisiologico, da qui il nome acido nucleico
3. BASE AZOTATA: contiene nella sua struttura azoto, conferisce le proprietà chimiche all'acido nucleico, proprietà chimiche di una base in soluzione; le basi azotate si distinguono in 2 classi: Purine: sono delle strutture a doppio anello di carbonio e azoto, tra di esse abbiamo: ADENINA (A), 6-amminopurina/ GUANINA (G) 2-ammino-6-ossipurina Pirimidine: hanno una struttura a singolo anello e comprendono: TIMINA (T) 2,4-diossi-5- metilpiriidina che specifica per il DNA, CITOSINA (C) 2-osso-4-amminapirimidina, URACILE (U) 2,4-diossipirimidina che specifica per RNA; quindi, nel RNA, al posto della TIMINA, avremo l'URACILE, la differenza tra queste due sta nella presenza del gruppo metilico CH3, che è presente nella TIMINA ma non nell'URACILE, questo metile ha una funzione importante, perché si pensa che il metile della TIMINA impedirebbe al DNA di uscire dal nucleo, mentre il metile mancante nell'URACILE permetterebbe a RNA di uscire dal nucleo e finire nel citoplasma.

COME SONO ASSEMBLATI QUESTI COMPONENTI NEL FORMARE NUCLEOSIDE E NUCLEOTIDE

• Base azotata è legata allo zucchero attraverso un legame N-glicosidico, perché viene creato con l'azoto della base azotata; questa struttura di base azotata + zucchero prende il nome di NUCLEOSIDE.
• Quando al nucleoside è legato il gruppo fosfato si forma il NUCLEOTIDE I nucleotidi possono essere:
• MONOFOSFATI
• DIFOSFATI
• TRIFOSFATI

La posizione dei fosfati si identifica attraverso le lettere greche, alpha beta e gamma; il gruppo fosfato in posizione alpha è quello che si trova nello scheletro degli acidi nucleici

COME SI LEGANO I NUCLEOTIDI TRA DI LORO

Mediante reazione di condensazione i nucleotidi si uniscono, cioè si polimerizzano tra di loro formando una catena polinucleotidica, in questo caso di DNA. Il filamento di DNA è costituito da nucleotidi adiacenti, legati tra di loro da legami covalenti fosfodiesterici 5'-3', si vengono a creare tra l'ossidrile fosfato al 5' di un nucleotide e l'ossidrile 3' di un altro nucleotide. Quindi abbiamo uno scheletro idrofilico nel filamento del DNA per via del gruppo fosfato che è idrofilo, costituisce lo scheletro in cui si alternano molecole di zucchero e fosfato legati tra di loro mediante legame 5'-3'. Questa catena polinucleotidica può essere molto lunga e il numero delle coppie di basi, vale a dire PB paia di basi, vengono utilizzate come unità di misura per determinare la lunghezza della catena; l'unità di misura più usata è il chilo base (kb) che corrisponde a 1000 paia di basi. Il filamento del DNA ha una sua direzionalità, significa che ogni gruppo fosfato è legato allo zucchero in posizione 5' e ad un altro in posizione 3', inoltre i nucleotidi vengono aggiunti sempre all'estremità 3', dove c'è OH libero; quindi, il filamento di DNA ha un'estremità 5' e 3', viene detta polarità o direzionalità 5'->3', caratteristica fondamentale.

5-0- NH2 p= Subunità nucleotidica N H CH O C -P=0 H 1-0- NH2 Base pirimidinica CH2 O Legami fosfodiesterici 5'-3' C P=0 Base purinica HO CH 0 NH2 C O-P=0 - CH Scheletro di zucchero-fosfato HC NH