Biologia Molecolare della Nutrizione: DNA, Epigenetica e Acidi Nucleici

BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA NUTRIZIONE

Introduzione alla Biologia Molecolare

PROFESSORESSA SIMONA DANIELE ANNO ACCADEMICO 2023/2024 ALICE CORTIINDICE Introduzione 1 Gli acidi nucleici nel cibo 3 Conformazioni del DNA 14 DNA Z e Alzheimer 15 Epigenetica 22 Metilazione del DNA 23 Rimodellamento della cromatina 34 Micro-RNA 42 Epigallocatechina gallato 46 Genisteina 47 Polimorfismi genetici 48

Il Dogma Centrale della Biologia

Il dogma centrale della biologia Riguarda il flusso di informazione genetica che porta dal DNA alla proteina per cui codifica: secondo questo dogma, dunque, l'informazione genetica fluisce da DNA a RNA a proteine. È un processo direzionale e, per lo meno negli organismi umani, non può essere percorso al contrario. Il flusso di informazione genetica si articola in:

• Duplicazione: il patrimonio genetico è duplicato grazie alla DNA polimerasi per trasferire il materiale genetico alle cellule figlie.
• Trascrizione: è il processo per cui si passa da DNA a mRNA (RNA messaggero) mediante l'azione della RNA polimerasi;
• Traduzione: l'RNA messaggero, con il codice che va di tripletta in tripletta, detta gli aminoacidi che danno origine alla proteina per azione del ribosoma.

replication (DNA -> DNA) DNA Polymerase DNA transcription (DNA -> RNA) RNA Polymerase RNA translation (RNA -> Protein) Ribosome Protein La principale differenza tra duplicazione e trascrizione, al di là del fatto che si ottengono due acidi nucleici diversi, è che nel secondo caso viene trascritta solo la porzione di interesse, ovvero la porzione che codifica per una proteina necessaria ad una determinata cellula in quelle determinate condizioni di stimolo ambientale o ormonale; nel primo caso, invece, viene duplicato l'intero codice genetico, che deve essere conservato. L'informazione genetica del DNA è estremamente ampia, e deve essere conservata in forma stabile e di dimensioni ridotte per lunghi periodi, ovvero in maniera ordinata e "impacchettata". D'altronde l'informazione genetica deve essere decodificata, spesso parecchie volte, al fine di poter essere usata, per cui ci sarà bisogno di meccanismi che la rendono accessibile, ovvero che consentano di "spacchettare" la forma ordinata in cui è conservata.

Struttura e Conformazione degli Acidi Nucleici

Struttura e conformazione degli acidi nucleici RNA e DNA sono dei polimeri di nucleotidi. I nucleotidi sono costituiti da una base azotata legata ad uno zucchero unito ad almeno un gruppo fosforico. 6 N. N. 5 71 8 2 4 9 3 N N H Purina 4 N3 5 2 6 1 N Pirimidina HO-CH2 5' O OH - H1' 3' 2' H OH OH Ribosio 5' HO-CH2 0 OH - 4'H H1' H H OH H Deossiribosio 5' Base -203PO-CH2 0 4'H H1' 3' 2' H H OH OH 5'-Ribonucleotide 5' Base HO-CH2 O 4'H H1' 3' 2' H H -203PO H 3'-Deossinucleotide 1 1 H 3' 2'(a). Basi azotate. Sono molecole planari, aromatiche, eterocicliche, derivati dalla purina e dalla pirimidina (ma non sintetizzate in vivo da questi composti). Dalla purina derivano adenina (A) e guanina (G), dalla pirimidina derivano citosina (C), uracile (U) e timina (T). I nucleotidi sono composti da una base azotata legata ad uno zucchero e ad almeno un gruppo fosforico. Nel DNA troviamo adenina, guanina, citosina e timina, mentre nell'RNA al posto della timina abbiamo l'uracile. (b). Zuccheri. Lo zucchero è il ribosio nel RNA, il 2-deossi-ribosio nel DNA (manca gruppo ossidrilico in 2). Sono entrambi zuccheri pentosi. La molecola composta da base azotata + zucchero è chiamata nucleoside. (c). Gruppo fosforico. Può legarsi al pentosio in posizione 5' e possiamo trovare da 1 a 3 gruppi fosforici. La molecola composta da base azotata + zucchero + gruppo/i fosforico/i è chiamata nucleotide. I nucleotidi del DNA e dell'RNA sono uniti tra loro in successione mediante "ponti" covalenti tra gruppi fosforici, in cui il gruppo ossidrilico 5' di un'unità nucleotidica è unito al gruppo ossidrilico 3' di quella successiva, formando un legame fosfodiesterico. Lo scheletro covalente degli acidi nucleici è costituito da un'alternanza di gruppi fosforici e di residui di pentosio, mentre le basi azotate, che sporgono dallo scheletro, possono essere considerate come gruppi laterali. Lo scheletro covalente del DNA e dell'RNA è idrofilo. Le purine e le pirimidine sono molecole idrofobiche e relativamente poco solubili in acqua a pH neutro. I gruppi funzionali più importanti delle basi puriniche sono gli atomi di azoto degli anelli, i gruppi carbonilici e i gruppi amminici esociclici. Tali gruppi instaurano specifici legami idrogeno che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici, specialmente del DNA, in quanto permettono l'interazione fra i due filamenti. Si vanno a formare, inoltre, interazioni fra le basi appartenenti allo stesso filamento, ovvero tra quelle impilate l'una sull'altra. 5' H 1 CHz ʒʹ N-HUN A N CH2 HO EN N H O 1 P CH -N I N N CH2 H N G N O N N- 1 CH3 CH2 H H HI N N T H N- N A O N H CI N-HO N N CH2 c O N N Omnim H-N OH H CH2 3' 5' Le interazioni tra basi di filamenti diversi sono specifiche: la guanina interagisce con la citosina formando 3 legami a idrogeno; timina e adenina formano 2 legami a idrogeno. Questa complementarità tra le basi è dettata non solo dal numero di legami ad idrogeno, ma anche dall'ingombro trasversale. I due filamenti hanno orientamento antiparallelo, ovvero direzionalità opposte (uno 3'>5', ovvero dal gruppo ossidrilico al gruppo fosfato, l'altro 5'>3', ovvero dal fosfato all'ossidrile), come conseguenza stereochimica dell'appaiamento tra basi. 2

GLI ACIDI NUCLEICI NEL CIBO

Contenuto di Acidi Nucleici negli Alimenti

Nunim H-N G c O N H P -N CH2 O !!!!!!! H-N N Tutti gli alimenti contengono acidi nucleici, il cui contenuto varia anche in relazione al tipo di manipolazione che subisce il cibo. La prima considerazione da fare è che a parità di manipolazione l'RNA è un acido nucleico fortemente più instabile del DNA, per cui va facilmente incontro a degradazione durante manipolazione e conservazione, e verrà più facilmente degradato nel tratto digerente. La quantità totale e il pattern di acidi nucleici negli alimenti variano a seconda della fonte (cibo animale, vegetale, fungino) e della densità degli acidi nucleici nelle cellule dell'alimento. Ne troviamo in quantità maggiore in lieviti e funghi e negli alimenti di origine animale. L'apporto alimentare di RNA e DNA varia ampiamente di individuo in individuo, ma è tipicamente compreso tra 0,1-1 g al giorno.

CONTRIBUTO DEGLI OGM

Mangiando cibo OGM, in quale percentuale introduciamo DNA modificato? Dipende dalla modifica apportata: ad esempio, nel mais reso più resistente agli insettio il tratto di DNA estraneo, detto anche ricombinante, è pari allo 0,00022%. Anche per altri alimenti OGM la percentuale rimane bassissima. Dobbiamo poi tenere presente che anche il DNA ricombinante va incontro alle modifiche per manipolazione e conservazione.

Crop Average genome Average insert Trait size (Mbp)1 size (kbp)2 % recDNA of genome3 Zea mais 2,292 5 Insect protected 0.00022 Solanum tuberosum 1,597 12 Insect protected 0.00075 Glycine max 1,115 2 Herbicide tolerant 0.00018 Beta vulgaris ssp. saccharifera 758 8 Herbicide tolerant 0.0011 Brassica napus 1,129 6 Herbicide tolerant 0.00053 Nell'immagine kbp sta per kilo paia basi, ovvero il numero sotto riportato deve essere moltiplicato per 1000 (es. nel caso del mais sono stati modificate 5000 basi appaiate), mentre Mbp sta per mega paia basi, per cui il numero sotto riportato deve essere moltiplicato per 106. Ma cos'è un OGM? È un organismo vegetale o animale nel cui DNA sono stati inseriti uno o più geni provenienti da un altro organismo o creati in laboratorio; questi geni esprimono una specifica funzione regolando la sintesi di una o più proteine. Queste conferiranno all'organismo - che ora chiameremo geneticamente modificato - una caratteristica nuova: dalla resistenza a parassiti, alla resistenza alla siccità, ecc.

Tecniche di Produzione degli OGM

Tecniche di produzione degli OGM Da sempre si è cercato di apportare modifiche al genoma di piante: a partire dal semplice incrocio tra specie, al più "moderno" bombardamento con raggi x per creare modifiche casuali nel genoma, per poi selezionare le modifiche vantaggiose. L'ingegneria genetica odierna, mediante un'operazione di "taglia e cuci" fa in maniera mirata ciò che prima si faceva in maniera casuale. Per la creazione degli OGM si inizia sintetizzando in laboratorio la sequenza nucleotidica codificante per la proteina di interesse, inserendola tipicamente in un DNA circolare che deve avere tutta una serie di caratteristiche specifiche. Questo poi deve essere immesso nella cellula ospite (esistono diverse tecniche) e si vanno quindi a selezionare le cellule con cui progredire verso la coltivazione transgenica.

TECNICHE DI PRIMA GENERAZIONE

Le prime tre tecniche che andremo a vedere sono dette di prima generazione, in cui il DNA ricombinante che si vuole introdurre nella cellula vegetale si addiziona al bagaglio di proteine già espresse dalla cellula vegetale senza integrazione nel genoma della cellula vegetale stessa. 3

Infezione mediante Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium Agrobacterium con plasmide circolare in cui sono inseriti i geni desiderati Agrobacterium coltivato con frammenti di tessuto vegetale per consentire il trasferimento del DNA alle cellule vegetali nucleo DNA con geni desiderati cromosomi in cui si è integrato il DNA con i geni desiderati cellula vegetale 1 moltiplicazione delle cellule vegetali (callo) sviluppo dei germogli, seguito dalla formazione delle radici pianta transgenica pistola genica metodo biolistico particelle ricoperte di DNA frammenti di tessuto vegetale bombardati con le particelle (a). Infezione mediante Agrobacterium tumefaciens L'A. tumefaciens è un batterio del terreno, che contiene oltre ad un suo cromosoma anche un plasmide, cioè un mini- cromosoma circolare in cui sono presenti geni responsabili dell'insorgenza del tumore nella pianta (efficacie su Dicotiledoni, non su Monocotiledoni). Tali geni vengono sostituiti con i geni selezionati (eliminazione geni che provocano il tumore + inserzione sequenza genica vantaggiosa) e il batterio così trasformato viene utilizzato per infettare il tessuto vegetale. I tessuti vegetali vengono posti su una piastra contenente terreno nutriente e vengono lesionati affinché il batterio attacchi la parete cellulare e introduca il plasmide trasformato. A questo punto si selezionano le cellule vegetali che hanno inglobato il DNA estraneo, mentre si scartano le altre. Quelle "infettate" vengono fatte moltiplicare in modo da dare origine a intere piante, che produrranno la proteina desiderata. I geni indesiderati vengono eliminati dal plasmide mediante enzimi < I geni scelti vengono introdotti nel plasmide Plasmide Cromosoma batterico Il nuovo plasmide entra nelle cellule dal bordo del ritaglio Dischetti di foglie poste su una sospensione di cellule di Agrobacterium Dischetti di foglie cresciute su un terreno nutriente selettivo - solo le cellule trasformate si moltiplicano Nell'Agrobacterium tumefaciens è inserito un nuovo plasmide Vengono riprodotte intere piante contenenti il gene introdotto 4