PCR (Polymerase Chain Reaction): principios y aplicaciones en biología molecular

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dyOE IES Moratalaz Biología Molecular

PCR A TIEMPO FINAL

1. INTRODUCCIÓN
2. FUNDAMENTO TEÓRICO
3. COMPONENTES DE LA REACCIÓN
4. ESQUEMA DE LA PCR CONVENCIONAL (PCR A TIEMPO FINAL)
5. EVITAR LA CONTAMINACIÓN
6. PCR MÚLTIPLE (o MULTIPLEX PCR)
7. RT-PCR

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INTRODUCCIÓN A LA PCR

» PCR: Técnica que genera in vitro un gran nº de copias de un determinado fragmento de ADN. >> Clonación molecular __ amplifica el ADN (o ARN, si previamente se sintetiza su ADN complementario o ADNc), sin emplear células (clonación acelular), simulando una replicación natural del ADN in vitro.

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HISTORIA DE LA TÉCNICA

» La técnica fue descrita, inicialmente, por Kleppe y col. en 1971 (en Journal of Molecular Biology). Sin embargo, este ensayo no recibió mucha atención, considerando que dicha metodología no era Kjell Kleppe ( 1934 - 1988 ) funcional.

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Desarrollo de la técnica por Kary Mullis

Kary Mullis · Desarrolló la técnica en 1983 autor "oficial" de la PCR. · Premio Nobel de Química en 1993. En 1989, la revista Science elige como "molécula del año" a la ADN polimerasa. Nacido en 1944 -

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Amplificación del ADN: antes y después de la PCR

· Antes del uso de la PCR, la amplificación del ADN in vivo (clonación celular), necesitaba: - manipulación del ADN, - transformación de células con dicho ADN recombinante y - replicación del ADN huésped en las células hospedadoras hasta alcanzar un nº suficiente que permitiera su estudio por las técnicas clásicas de BM. Inconveniente de la tecnología clásica de clonación in vivo - proceso muy laborioso.

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Ventajas de la PCR

· PCR: clonación in vitro -podemos amplificar en un tubo de ensayo, una secuencia de ADN determinada, millones de veces y, además, en un tiempo mínimo de horas. Hoy - + herramienta fundamental en cualquier laboratorio de BM.

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Muestra para hacer PCR

» extractos crudos de tejido, » sangre completa, » mezclas de fragmentos de ADN obtenidos con enzimas de restricción, » muestras resultantes de la extracción y aislamiento de ADN, etc. Imprescindible: conocer la secuencia de una parte de la región de ADN o ARN que se quiere amplificar.

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Objetivo básico de la PCR

AMPLIFICACIÓN propiamente dicha Para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo, con fines diversos Objetivo básico de la PCR: amplificar DNA DETECCIÓN Para poderlo detectar en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana

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Variantes de la técnica PCR

» Aunque en un principio se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido amplificar fragmentos de gran tamaño (hasta 35 Kb) y se han desarrollado diferentes variantes que permiten: Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple). Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR). · Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra (PCR cuantitativa, PCR a tiempo real).

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Aplicaciones de la PCR

· Muy variadas tanto en: - Ciencia básica, detección y/o generación de fragmentos de ADN de interés. - Ciencia aplicada, patología, paleontología, antropología biológica, medicina forense, control alimentario, diagnóstico clínico, etc.

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Ejemplos de aplicaciones de la PCR

» clonación acelular de fragmentos de ADN. » detección de secuencias, sin purificación previa. » preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos. » establecimiento de polimorfismo de secuencia. » rastreo de mutaciones. » tipificación de ADN para trasplantes. » diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el diagnóstico prenatal). » determinación de secuencias específicas de ADN relacionadas con situaciones patológicas definidas.

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Más ejemplos de aplicaciones de la PCR

» marcadores genéticos para aplicaciones forenses (amplificación e identificación de ADN de saliva, semen, sangre, cabellos ... en casos criminales). » pruebas de paternidad. » arqueología y paleontología (amplificación de material genético obtenido de momias y fósiles). » estudios evolutivos. » detección de microorganismos infecciosos. » detección de células tumorales. » amplificación de ADN para su posterior clonación celular. » determinación de la presencia de organismos modificados genéticamente y para la autentificación de productos (detectar fraude por sustitución de especies por otras de menor valor comercial), etc.

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FUNDAMENTO TEÓRICO

· Replicación in vitro del ADN - amplificación selectiva de una determinada secuencia de ADN (ADN molde): uso de 2 cebadores (primers) complementarios a las secuencias situadas en los extremos del fragmento de ADN molde que se desea amplificar. REGIÓN DE DNA DE LONGITUD VARIABLE 3 cebador 1 5 5' secuencia diana 1 3 3' secuencia diana 2 5 cebador 2 (oligo) 3 5' fragmento diana: región de la molécula de DNA que será amplificada

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Fragmento de ADN a amplificar

5' 3 1 5° ADN molde Cebador F 1 V 3' Fragmento que se quiere amplificar Cebador R 5' 3'

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Proceso de amplificación del ADN por PCR

· Una secuencia le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela. · También la síntesis de la cadena sigue la dirección 5'-> 3' - requiere de un nucleótido (nt) con el extremo 3' libre - proporciona el grupo OH para la adición del siguiente nucleótido (enlace fosfodiéster).

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Etapas de la PCR

PCR: varios ciclos de 3 etapas: 1) Desnaturalización de la doble hebra de ADN (95ºC), para dar moléculas monocatenarias. 2) Anillamiento 0 alineamiento 0 annealing: hibridación específica de los dos cebadores o primers a sus secuencias complementarias monocatenarias. 3) Elongación o extensión o polimerización: replicación de la molécula monocatenaria.

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Esquema de las etapas de la PCR

Etapas de la PCR 1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena 2. Alineamiento: Anillaje de primers 3. Extensión: Generación de la nueva cadena 30 ciclos Desnaturación Desnaturación 100 Temperatura 94 ℃ Extension 94 ℃ 72 ℃ 50 50-60°C Anillaje 0 Tiempo

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Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Secuencia de ADN a amplificar Primers o partidores PCR Fluorescente Electroforesis Sintesis de ADN, elongación de cadenas Desnaturalización y fijación de primers

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1) Desnaturalización del ADN

· De la doble hebra de ADN por calor (95ºC) - para dar moléculas monocatenarias (apertura de la doble cadena) y permitir que ocurra el siguiente paso. Se busca suplir por medios físicos (temperatura) la actividad de las enzimas presentes en la síntesis in vivo.

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2) Anillamiento o alineamiento

· O annealing (anillaje de primers) - - hibridación específica de los dos cebadores o primers a sus secuencias complementarias monocatenarias a 50-70 ºC; la temperatura dependerá de la composición de bases de los cebadores. Esta es la etapa que justifica por qué se debe conocer parte de la secuencia.

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3) Elongación o extensión o polimerización

· Replicación de la molécula monocatenaria mediante una ADN polimerasa a partir del cebador - capaces de adicionar dNTPS a partir de la región 3' de un cebador y copiar una secuencia molde. Las ADN polimerasas requieren Mg++ como cofactor para ser funcionales. · Se emplea una ADN polimerasa termoestable (72ºC).

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Evolución de las polimerasas en PCR

Al comienzo de la técnica, se utilizó: polimerasa aislada de E.coli (fragmento Klenow de la ADN polimerasa I): actividad óptima a 37º C, y se inactiva a 94º C en cada ciclo era necesario agregar más enzima. Luego, se sustituyó por una polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus (Taq), una bacteria termófila que vive en las fuentes de agua termal (entre 50 y 80 ºC) Taq soporta 95 ºC - permitió automatizar el proceso (en un termociclador).

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Thermus aquaticus

Thermus aquaticus Vive en las fuentes termales Estable a altas temperaturas

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Ciclos y amplificación exponencial

· Las 3 etapas constituyen un ciclo - la cantidad de ADN se ha duplicado. · Amplificación exponencial o logarítmica - las cadenas previamente sintetizadas pueden servir de molde a futuras amplificaciones. · En teoría, mientras los reactivos no se agoten, el nº de copias obtenidas debería ser de 2" (n = nº de ciclos). En la práctica el rendimiento es más bajo.

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Representación de la amplificación exponencial de la PCR

Amplificación exponencial de la PCR Gen de interés ADN molde VV VV VV V 1er ciclo 2do ciclo (entre otros productos) 3ºº ciclo 2 moléculas V 41º ciclo 51º ciclo 6º ciclo 40º ciclo 22 =4 moléculas 23 = 8 moléculas 24 = 16 moléculas 238 _ 274.877.906.944 moléculas

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Fases de la cinética de amplificación de PCR

La cinética de amplificación de PCR se describe en 3 fases: · Fase inicial o fase lag (hasta 5 ciclos =): la cantidad de amplicones no es detectable por el termociclador. Es una zona de ruido. Su amplitud depende de la cantidad de secuencias diana de la muestra. · Fase exponencial (hasta el ciclo 20 =): en cada ciclo se duplican los fragmentos producidos en el ciclo anterior. · Fase plateau o meseta: no se produce más amplificación probablemente por el agotamiento de los sustratos, pérdida progresiva de la actividad polimerasa, saturación del enzima, etc .. Plateau Linear PCA Product Exponential Crossing Threshold Cycle

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Número de ciclos en PCR

En general, en una PCR el nº de ciclos varía entre 25 y 40.

COMPONENTES DE LA REACCIÓN

a) dNTP (Desoxinucleotidostrifosfato: dATP, dGTP, dCTP, dTTP), en exceso y en cantidades equimolares. b) MgCl2, cofactor enzimático. c) Dos cebadores (primers o iniciadores). d) ADN polimerasa termoestable: resiste 30-40 s a 95ºC. e) Tampón: regulación del pH. f) ADN molde. g) Agua.

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a) Los 4 dNTP

· dATP, dCTP, dGTP, dTTP: Los desoxinucleotidos, sustratos para la síntesis de las copias de ADN (son los "ladrillos" para construir las nuevas cadenas de ADN). · Deben estar presentes en la misma concentración, pues en caso contrario disminuye la fidelidad del enzima. En general se suministran concentrados de 10 mM (2,5 mM de cada dNTP). La concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dNTP es 200 uM exceso y en cantidades equimolares (50 - 200 μΜ): -> 200 µM - pueden producir incorporaciones erróneas. -< 50 µM - síntesis inadecuada.

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b) MgCl2 como cofactor enzimático

. Los dNTP deben ir acompañados de Mg2+ para ser reconocidos por la polimerasa. · Mg2+ : Cofactor de la ADN polimerasa. · 1 y 4 mM. Optimizarse de manera experimental para cada PCR: - un exceso de Mg ->amplificación inespecífica de productos de PCR, - una baja concentración - la producción del amplificado (V rendimiento). · Cada polimerasa requiere una concentración óptima del ion, por lo que algunos fabricantes suministran junto al enzima el tampón a concentración adecuada; otros fabricantes suministran el enzima y aparte el tampón concentrado.