Introducción a la Histología: tejido celular y clasificación

Conceptos Fundamentales de Histología

ODefinir que es un tejido celular. OEnumerar los diferentes tipos de tejidos y su clasificación. ODescribir los diferentes pasos del procesamiento histológico para microscopia óptica y electrónica. OIdentificar el colorante y tecnica apropiados para la demostración de un tejido o estructura celular específicos. OIdentificar, a partir de imágenes, secciones teñidas con tinciones topográficas, histoquímicas, inmunocitoquímicas, inmunofluorescencia, micrografías electrónicas de transmisión y de barrido.Concepto de Histología. Definición de tejido

Histología: Estudio de las estructuras microscópicas de los tejidos. (Tortora y Derrickson) Tejido: Grupo de células y material circundante que trabajan en conjunto para cumplir una determinada función. (Tortora y Derrickson)

Niveles de Organización Celular

2 CELLULAR LEVEL 1 CHEMICAL LEVEL 3 TISSUE LEVEL Smooth muscle cell Atoms (C, H, O, N, P) Smooth muscle tissue Molecule (DNA) 5 SYSTEM LEVEL Epithelial and connective tissues 4 ORGAN LEVEL Salivary glands Mouth Pharynx (throat) Smooth muscle tissue layers Esophagus Epithelial tissue Stomach Stomach Liver Pancreas (behind stomach) Gallbladder Large intestine Small intestine 6 ORGANISMAL LEVEL Digestive system

Clasificación de Tejidos Fundamentales

• Tejidos epiteliales - epitelios de revestimiento - epitelios glandulares
• Tejidos conectivos – conjuntivo - sanguíneo - adiposo - cartilaginoso - óseo
• Tejidos musculares - muscular liso - muscular esquelético - muscular cardiaco
• Tejido nervioso

Clasificación de Tejidos Epiteliales y Conectivos

• Tejidos epiteliales - epitelios de revestimiento - epitelios glandulares
• Tejidos conectivos - conjuntivo - sanguíneo - adiposo - cartilaginoso - óseo
• Tejidos musculares - muscular liso - muscular esquelético - muscular cardiaco
• Tejido nervioso

Clasificación de Tejidos Musculares y Nerviosos

• Tejidos epiteliales - epitelios de revestimiento - epitelios glandulares
• Tejidos conectivos - conjuntivo - sanguíneo - adiposo - cartilaginoso - óseo
• Tejidos musculares - muscular liso - muscular esquelético - muscular cardiaco
• Tejido nervioso

Clasificación de Tejidos: Epiteliales, Conectivos, Musculares y Nerviosos

• Tejidos epiteliales - epitelios de revestimiento - epitelios glandulares
• Tejidos conectivos - conjuntivo - sanguíneo - adiposo - cartilaginoso - óseo
• Tejidos musculares - muscular liso - muscular esquelético - muscular cardiaco
• Tejido nervioso

Clasificación de Tejidos: Resumen

• Tejidos epiteliales - epitelios de revestimiento - epitelios glandulares
• Tejidos conectivos - conjuntivo - sanguíneo - adiposo - cartilaginoso - óseo
• Tejidos musculares - muscular liso - muscular esquelético - muscular cardiaco
• Tejido nervioso

Concepto de Histología y Microscopía

0Concepto de Histología. "Estudio de las estructuras microscópicas de los tejidos" (Tortora y Derrickson) ¿CÓMO? X MICROSCOPIO M.O., M.E., etc Disección Shawn Miller, fotografía Mark Nielsen Tortora, GJ y Derrickson, B. Principios de anatomía y fisiología, 15ª edición. Ed. Médica Panamericana CS CB CB a Young, Barbara et al., Wheater. Histología funcional, 2014 Sexta edición, Elsevier España, S.L. PREPARACIONES HISTOLÓGICAS Cortes, frotis, etc

Procesamiento Histológico para Microscopía Óptica y Electrónica

OBTENCIÓN del TEJIDO FIJACIÓN INCLUSIÓN CORTE CONTRASTE / TINCIÓN OBSERVACIÓN CB CB Para saber más: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/1-introduccion.php

Procesamiento Histológico Detallado

Obtención del Tejido

OBTENCIÓN del TEJIDO PORCIÓN DE TEJIDO VEGETAL 0 BIOPSIA ANIMAL ÓRGANO 0 ANIMAL COMPLETO

Fijación y Congelación

CONGELACIÓN FIJACIÓN INMERSIÓN PERFUSIÓN

Inclusión y Corte

INCLUSIÓN RESINAS PARAFINA CELOIDINA CORTE ULTRAMICROTOMO MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN

Contraste, Tinción y Observación

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO Para saber más: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/1-introduccion.php

Procesamiento Histológico: Etapas y Técnicas

Obtención de Muestras

OBTENCIÓN del TEJIDO PORCIÓN DE TEJIDO VEGETAL 0 BIOPSIA ANIMAL ÓRGANO 0 ANIMAL COMPLETO

Fijación y Preparación

CONGELACIÓN FIJACIÓN INMERSIÓN PERFUSIÓN

Inclusión y Seccionamiento

INCLUSIÓN RESINAS PARAFINA CELOIDINA CORTE MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN ULTRAMICROTOMO

Visualización

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO Para saber más: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/1-introduccion.php

Fijación de Tejidos

· Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc ... · Endurecer el tejido para permetir su manipulación y evitar alteraciones morfológicas. · Mantenimiento de la citoarquitectura y ultraestructura. · Mantenimiento in situ de las moléculas (Importante para determinaciones histoenzimáticas e inmunocitoquímicas) Fijadores: aldehidos, alcoholes, mercurio, ácido pícrico Formol: formaldehido + metanol Parafolmadehido: formaldehido en tampón fosfato Bouin: ácido pícrico + formol + ácido acético Karnoy: etanol + cloroformo + ácido acético Para saber más: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-fijadores.php

Métodos de Fijación: Inmersión y Perfusión

Fijación por Inmersión

Immersión Fijador Muestra Fijación por inmersión. Precauciones: · Tamaño de las piezas ·Volumen del fijador ·Osmolaridad ·Ph ·Tiempo de fijación

Perfusión Intracardíaca

Perfusión intracardíaca Riego corporal rostral Riego pulmonar Solución fijadora Solución de lavado Ad Abertura en la aurícula Ai 1 Vi 1 Vd Riego corporal caudal Bomba peristáltica • Se utiliza el riego sanguíneo para llegar a los diferentes órganos • Se obtienen mejores resultados

Esquema del Proceso Histológico

Obtención y Fijación

OBTENCIÓN del TEJIDO PORCIÓN DE TEJIDO VEGETAL 0 BIOPSIA ANIMAL ÓRGANO O ANIMAL COMPLETO CONGELACIÓN FIJACIÓN INMERSIÓN PERFUSIÓN

Inclusión y Corte

INCLUSIÓN RESINAS PARAFINA CELOIDINA CORTE MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN ULTRAMICROTOMO

Contraste, Tinción y Observación

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO Esquema del proceso histológico.

Procesamiento por Congelación o Inclusión

Secciones y Fijación

Secciones (20-200 μm) Vibratomo Microtomo de congelación Secciones (20-100 um) Fijación

Ultracriotomo y Congelación

Ultracriotomo Congelación Muestra de tejido Rejilla Anticongelante Secciones (50-90 nm)

Parafina, Resina y Criostato

Parafina 0 resina Criostato Parafina Secciones (10-50 um) Resina

Inclusión y Ultramicrotomo

INCLUSIÓN Ultramicrotomo Secciones (5-20 pm) Secciones (50-90 nm) Portaobjetos Rejilla Microtomo Portaobjetos

Método de Inclusión en Parafina

Fijación y Deshidratación

FIJACIÓN Muestra Perfusión Inmersión DESHIDRATACIÓN H20 3×10 min Etanol 70° 3×10 min Etanol 90° 3×10 min Etanol 96° 3×10 min Etanol 100° 4×10 min

Líquido Intermediario y Estufa

LÍQUIDO INTERMEDIARIO Xileno 3×10 min ESTUFA - 60 ℃ Parafina liquida 1 hora Parafina líquida 1 hora Parafina líquida 2 horas Rarafina líquida

Encastramiento

ENCASTRAMIENTO Molde E Bloque de parafina retallado Bloque de parafina

Método de Inclusión en Resina

Fijación y Lavados

FIJACIÓN Glutaraldehido Tetróxido de osmio Lavados en solución tamponada Perfusión Muestra Inmersión

Deshidratación y Líquido Intermediario

DESHIDRATACIÓN H20 3×10 min Etanol 70" 3x10 min Etanol 90" 3x10 min Etanol 96° 3x10 min Etanol 100° 4×10 min LÍQUIDO INTERMEDIARIO Óxido de propileno 3×10 min Óxido de propileno:resina (1:1) Hasta la evaporación del óxido de propileno. Entre 10 y 20 horas, dependiendo de la cantidad de solución utilizada.

Resina y Polimerización

Resina Molde POLIMERIZACIÓN ESTUFA ~ 60 ℃ 48 horas Bloque de resina polimerizada Enfriamiento

Proceso de Inclusión y Deshidratación

Deshidratación Gradual

DESHIDRATACIÓN GRADUAL alcohol INTERMEDIARIO Miscible en alcohol y en parafina/resina Dis. orgánico: xileno/ óxido propileno

Inmersión y Solidificación

INMERSIÓN Parafina/ resina SOLIDIFICACIÓN Bloque

Fijación y Deshidratación en Parafina

FIJACIÓN Muestra Perfusión Inmersión DESHIDRATACIÓN H20 3×10 min Etanol 70° 3×10 min Etanol 90° 3×10 min Etanol 96° 3×10 min Etanol 100° 4×10 min

Líquido Intermediario y Encastramiento en Parafina

LÍQUIDO INTERMEDIARIO Xileno 3×10 min ESTUFA - 60 ℃ Parafina liquida 1 hora Parafina líquida 1 hora Parafina líquida 2 horas Rarafina líquida Enfriamiento ENCASTRAMIENTO Molde E Bloque de parafina retallado Bloque de parafina

Fijación y Deshidratación en Resina

FIJACIÓN Glutaraldehido Tetróxido de osmio Lavados en solución tamponada Perfusión Muestra Inmersión DESHIDRATACIÓN H20 3×10 min Etanol 70" 3x10 min Etanol 90" 3x10 min Etanol 96° 3x10 min Etanol 100° 4×10 min

Líquido Intermediario y Polimerización en Resina

LÍQUIDO INTERMEDIARIO Óxido de propileno 3×10 min Óxido de propileno:resina (1:1) Hasta la evaporación del óxido de propileno. Entre 10 y 20 horas, dependiendo de la cantidad de solución utilizada. Resina Molde POLIMERIZACIÓN ESTUFA ~ 60 ℃ 48 horas Bloque de resina polimerizada

Procesamiento Histológico Completo

Obtención del Tejido

OBTENCIÓN del TEJIDO PORCIÓN DE TEJIDO VEGETAL 0 BIOPSIA ANIMAL ÓRGANO 0 ANIMAL COMPLETO

Congelación y Fijación

CONGELACIÓN FIJACIÓN INMERSIÓN PERFUSIÓN

Inclusión y Corte

INCLUSIÓN RESINAS PARAFINA CELOIDINA CORTE MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN ULTRAMICROTOMO

Contraste, Tinción y Observación

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO Esquema del proceso histológico.

Obtención de Cortes Histológicos

Microtomo de Parafina

Microtomo de parafina Portabloques Bloque Cuchilla Movimiento de corte Pincel Portaobjetos Agua 1 Estufa a 40 ºC Tira de secciones Portaobjetos con cortes estirados tras evaporarse el agua

Ultramicrotomo

Ultramicrotomo Secciones Bloque con muestra Rejilla Secciones flotando en la balsa de aqua t Pinzas

Técnicas de Corte: Vibratomo y Criostato

Vibratomo

Vibratomo Movimiento vibratorio Movimiento avance-retroceso Cuchilla Cortes en flotación Muestra Tampón de trabajo Plataforma elevadora

Criostato (Microtomo de Congelación)

Criostato (Microtomo de congelación) LEICA

Tipos de Cortes en Microscopía

Corte para Microscopía Óptica y Electrónica

CORTE ULTRAMICROTOMO MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN

Clasificación de Cortes

ULTRAFINOS < 100 nm (50-90nm) SEMIFINOS 0,5 - 2 um FINOS 3 - 10 um GRUESOS > 10 um

Procesamiento Histológico y Tipos de Cortes

Corte y Microscopía

CORTE ULTRAMICROTOMO MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN

Clasificación de Cortes por Grosor

ULTRAFINOS < 100 nm (50-90nm) SEMIFINOS 0,5 - 2 um FINOS 5 - 10 um GRUESOS > 10 um

Contraste, Tinción y Observación

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO

Esquema del Proceso Histológico Completo

Obtención del Tejido

OBTENCIÓN del TEJIDO PORCIÓN DE TEJIDO VEGETAL 0 BIOPSIA ANIMAL ÓRGANO 0 ANIMAL COMPLETO

Congelación y Fijación

CONGELACIÓN FIJACIÓN INMERSIÓN PERFUSIÓN

Inclusión y Corte

INCLUSIÓN RESINAS PARAFINA CELOIDINA CORTE MICROTOMO VIBRATOMO CRIOSTATO MICROTOMO DE CONGELACIÓN ULTRAMICROTOMO

Contraste, Tinción y Observación

CONTRASTE TINCIÓN OBSERVACIÓN MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO Esquema del proceso histológico.

Comparación 3D vs 2D

3D vs 2D

Tinciones Histológicas

· Técnicas topográficas o generales · Técnicas específicas · Técnicas histoquímicas · Técnicas inmunocitoquímicas