Crecimiento Bacteriano: Fisión Binaria y Factores Ambientales en Biología

Crecimiento Celular y Fisión Binaria

T7. CRECIMIENTO BACTERIANO1. Crecimiento celular y fisión binaria. 2. Crecimiento de poblaciones. Curva de crecimiento 3. Determinación del crecimiento bacteriano: A. Medidas directas del crecimiento microbiano: recuento de células totales y viables. B. Medidas indirectas del crecimiento microbiano: turbidez. 4. Efectos ambientales sobre el crecimiento microbiano: 5. Efecto de la temperatura. 6. Efecto del pH. 7. Efecto de la osmolaridad. 8. Efecto del oxígeno. 9. Cultivo bacteriano.Crecimiento celular y fisión binaria.

Pared celular Membrana plasmática 1 La célula se alarga y el DNA se replica.

DNA (nucleoide) 2 Comienza el crecimiento hacia adentro de la pared celular y la membrana plasmática.

3 Se forma el tabique, que separa por completo las dos copias de DNA.

1 4 Las células se separan. (a) Diagrama de la secuencia de la división celular La mayoría de bacterias división por FISIÓN BINARIA o BIPARTICIÓN (formación 2 células a partir de una).

DNA (nucleoide) Tabique parcialmente formado Pared celular (b) Corte delgado de una célula de Bacillus licheniformis que comienza a dividirse MET 0,5 Lm

Crecimiento de Poblaciones Bacterianas

Definición y Velocidad de Crecimiento

Crecimiento de poblaciones. Crecimiento poblacional hace referencia al incremento del número de células. · La velocidad de crecimiento se define como el cambio en el número de células o en la masa celular expresado por unidad de tiempo. · Tiempo de generación (tiempo de duplicación): el tiempo que se requiere para que la población se duplique.

• Depende de: - La especie del microorganismo (fundamentalmente) Para la mayoría de bacterias patógenas el tiempo de generación es corto (20-60 min), aunque algunas como Mycobacterium tuberculosis puede tardar hasta 20 horas en duplicarse. - Medio de crecimiento. - Condiciones de cultivo. ¿Cuanto mayor sea el tiempo de generación la velocidad de crecimiento será mayor o menor?

Crecimiento Exponencial

Crecimiento de poblaciones. Time (h) Total number of cells Time (h) Total number of cells 0 1 4 256 (28) 0.5 2 4.5 512 (29) 1 4 5 1,024 (210) 1.5 8 5.5 2,048 (211) 2 16 6 4,096 (212) 2.5 32 . . 3 64 . . 3.5 128 10 1,048,576 (219) El crecimiento bacteriano es de tipo exponencial: modelo de crecimiento poblacional en el que en cada período fijo de tiempo se dobla el número de células. Las bacterias aumentan a razón de 2n. Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad de crecimiento es inicialmente lenta pero se va incrementando con el tiempo. Esto determina que en las últimas etapas el crecimiento sea realmente explosivo.

Curva de Crecimiento y Fases

Crecimiento de poblaciones. Curva de crecimiento Curva de crecimiento: fase exponencial Time (h) Total number of cells Representación del 0 1 0.5 2 1 4 1.5 8 2 16 2.5 32 función del tiempo. 3 64 4 256 (28) 4.5 512 (29) 5 1,024 (210) 5.5 2,048 (211) 6 4,096 (212) · . 10 1,048,576 (219) 1000 103 Logarithmic plot Arithmetic plot - 10ª 500 - 10 Number of cells (logarithmic scale) 100 1 0 1 2 3 4 5 Time (h) Representación del logaritmo del número de células en función del tiempo. Gráfica semilogarítmica se obtiene una línea recta. La pendiente de la recta representa el tiempo de generación. Number of cells (arithmetic scale) número de células en Gráfica aritmética se obtiene una curva.

Crecimiento de poblaciones. · Aunque el crecimiento bacteriano es exponencial, no es ilimitado ya que los nutrientes del medio se van agotando. · Las fases del crecimiento de las poblaciones bacterianas son: 2 a Registro de número de bacterias ase de Fase Fase atencia exponencial estacionaria Fase de muerte Crecimiento teórico I I 1 1 I - 1 I I I I I I I I Tiempo

Crecimiento de poblaciones. Curva de crecimiento 1 Fase de latencia: Tiempo necesario para la adaptación de las bacterias al medio. 2 Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo, actividad metabólica máxima. Esta fase se mantendría de forma indefinida si regeneraramos continuamente los nutrientes. 3 Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc. El número de células que se dividen se equiparan con las que mueren. 4 Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen. En algunas especies se estimula la formación de esporas. Fow live cais 10 Many live cells Stationary phase Dead cells Death phase 6 4- 2- Lag phase 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Hours Logarithm (10") of Viable Cells B Exponential growth phase Some cells romain viable.

Determinación del Crecimiento Bacteriano

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANODeterminación del crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano se mide estimando los cambios en el número de células, en la cantidad de algún componente de las mismas o en el peso total seco de las células.

Métodos de Medida del Crecimiento

MÉTODOS DE MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO A. Medidas directas: a) Recuento del número de células totales:

• Cámaras de recuento.
• Contadores automáticos. Tipo Coulter. b) Recuento de células viables > Recuento de colonias en placa:
• Método de extensión en placa.
• Método de vertido en placa.
• Recuento mediante diluciones. B. Medidas indirectas:
• Medida de la turbidez.

Medidas Directas: Cámaras de Recuento

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas a) Recuento de células totales: CÁMARAS DE RECUENTO · Portas de vidrio excavados que presentan una cuadrícula grabada con cuadrados de área conocida > conocemos el volumen de muestra que tenemos en la cámara. · En el microscopio podemos contar el número de células por cada unidad de área de la cuadrícula. · La conversión de ese valor a numero de células/mL se hace multiplicando por un factor de conversión que depende del volumen del tipo de cámara. · Ejemplos: Camara Neubauer, Burker, Petroff-Hausser ... Limitaciones: No distingue las células vivas de las muertas. Las células pequeñas son difíciles de ver en el microscopio. Método no adecuado para suspensiones de baja densidad celular.

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas. Recuento células totales Ej. Recuento microscópico directo de bacterias con una cámara de Petroff-Hausser. Cuadrícula con 25 cuadrados grandes Cubreobjetos Cámara C 1 Aquí se agrega la suspensión bacteriana que llena el volumen poco profundo de la cámara por capilaridad.

Suspensión bacteriana Cubreobjetos Cámara Localización de la cuadrícula 2 Corte de una cámara de recuento. Se conoce la profundidad por debajo del cubreobjetos y el área de la cuadrícula, de manera que se puede calcular el volumen de la suspensión bacteriana en la cuadrícula (profundidad x área).

3 Recuento microscópico: se cuentan todas las células de varios cuadrados grandes y se calcula el promedio. El cuadrado grande aquí mostrado tiene 14 células bacterianas.

4 El volumen de líquido sobre el cuadrado grande es de 1/1 250 000 de un mililitro. Si contiene 14 células, como se ilustra aquí, entonces hay 14 × 1 250 000 células en un mililitro = 17 500 000 células en un mililitro. El número promedio de células dentro de un cuadrado grande multiplicado por un factor de 1.250.000 da el número de bacterias por mililitro.

Medidas Directas: Recuento de Células Viables

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas b) Recuento de células viables: contar el número de células de la muestra que son capaces de formar colonias sobre un medio sólido adecuado. No contabiliza bacterias muertas. El recuento de células viables se expresa en unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL) Métodos:

• METODO DE EXTENSION EN PLACA.
• MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA.
• RECUENTO MEDIANTE DILUCIONES. Limitaciones: Procedimiento lento. Mínimo 24 horas. Tamaño del inóculo. Condiciones y tiempo de incubación.

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas. Recuento de células viables MÉTODO DE EXTENSIÓN EN PLACA. & Surface colonies Incubation Deborah O. Jung Typical spread-plate results La muestra se pipetea en la superficie del agar (0,1 ml o menos) La muestra se reparte por la superficie del agar MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA. Surface colonies Solidification and incubation Subsurface colonies Deborah O. Jung La muestra se pipetea dentro de la placa estéril (0,1-1,0 ml) El medio estéril se añade y se mezcla con el inóculo Typical pour-plate results ¿Qué pasa si la concentración de bacterias en la muestra es muy elevada?

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas. Recuento de células viables (a) Método de la placa vertida (b) Método de diseminación en placa 1 o 0,1 ml 0,1 mL 1 Inocular una placa vacía.

1 Inocular la placa que contiene medio sólido.

Dilución bacteriana 2 Extender el inóculo de forma uniforme sobre la superficie.

2 Agregar agar nutritivo fundido.

3 Girar suavemente para mezclar.

4 Las colonias crecen sobre el medio solidificado y en su interior.

3 Las colonias crecen solo en la superficie del medio.

Recuento Mediante Diluciones

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas directas. Recuento de células viables RECUENTO MEDIANTE DILUCIONES Dilución de las suspensiones celulares antes de la siembra en placa · El inóculo original se diluye en una serie de tubos. · En el ejemplo, cada tubo de dilución sucesiva tendrá solo la décima parte del número de células microbianas del tubo precedente. · Se utilizan muestras de la dilución para inocular placas de Petri, en las cuales crecerán las colonias y podrán ser contadas. · Este recuento se utiliza para estimar el número de bacterias presentes en la muestra original. 1 ml Sample to be counted 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9-ml broth Total dilution (10-1) 1/10 1/100 (10-2) 1/103 (10-3) 1/104 (10-4) 1/105 (10-5) 1/106 (10-6) Plate 1-ml samples L 159 colonies 17 colonies 2 0 Too many colonies to count colonies colonies 159 × 103 Plate Dilution count factor = 1.59 x 105 Cells (colony-forming units) per milliliter of original sample

Medidas Indirectas: Turbidez

Determinación del crecimiento bacteriano. Medidas indirectas MEDIDA DE LA TURBIDEZ Una suspensión celular aparece turbia a la vista porque las células dispersan la luz que la atraviesa. Light Prism Incident light, lo Filter Sample containing cells (O) Unscattered light, I Photocell (measures unscattered light, I) Spectrophotometer Wavelength 540 OD 0.32 Optical density (OD) = Log 1 · Cuantas más células estén presentes mayor será la dispersión y por tanto mayor turbidez. . La turbidez puede medirse con aparatos como el ESPECTROFOTÓMETRO, que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la cantidad de luz emergente no dispersada. · Las lecturas se expresan en unidades de densidad óptica (D.O). · Son necesarias de 10 a 100 millones de células por mL para que la turbidez pueda ser leída en un espectofotómetro.