Electroforesis capilar y sus aplicaciones en biología molecular

Electroforesis Capilar: Aplicaciones en Biología Molecular

Análisis de fragmentos

• Discriminación alélica por tamaño
• Análisis de STRs
• MLPA
• QF-PCR

Secuenciación de ADN (Se estudia en otro tema)

Discriminación Alélica por Tamaño

Existen diferentes enfermedades causadas por expansión de tripletes (mutación en donde un triplete se repite más veces de lo normal):

• Síndrome X frágil
• Distrofia miotónica
• Atrofia muscular bulboespinal
• Enfermedad de Huntington
• Otras

Síndrome X Frágil (FMR-1)

5' AAAAA (CGG)7-50

Atrofia Muscular Espinobulbar (receptor de andrógenos)

5' AAAAA (CAG)11-31

Distrofia Miotónica (Myotonin kinasa)

5' AAAAA (CTG)5-35

Enfermedad de Huntington (huntington)

5' AAAAA (CAG)11-34

Síndrome X-Frágil

Pares cromosómicos

10 X Frágil 13 88 88 21 19 20 2 (hombre)

Síndrome de Martin-Bell

Discriminación Alélica por Tamaño: Ejemplo Síndrome de X Frágil

» ENFERMEDAD : Síndrome de X Frágil » FRECUENCIA 1/5000 varones » GEN FMR1 » CROMOSOMA Xq27.3 » ALTERACIÓN Expansión (CGG)n » HERENCIA XD » ANÁLISIS PCR / AF / SB (AF: análisis de fragmentos por EC; SB: Southern Blot)

Discriminación Alélica por Tamaño: Gen FMR1

Síndrome de X Frágil

FMRi gene (Xc)27.3) ATG Bion 1 Spreading, transcriptional silencing (CCG) Normal (6-50) CpG Methyl-OpG Carrier (50-200) ㅎ ㅎ ㅎ ㅎ ㅎ ㅎ Pragle K syndrome (>200)

Discriminación Alélica por Tamaño: Repeticiones CGG

Síndrome de X Frágil

Normal 5- +50 Repeats CGG FMR-1 gene Premutation 50- +200 (CGG)n Repeats CGG FMR-1 gene CGG |CGG GGG |CGG | CGG NTM 50-200 copies 1 CƠG CÔG CỤC |OGG|0GG Daughter 1 copies 1 Affected individual 200-1300 copies FMR-1 gene

Distribución de exones en FMR1

(CGG)n Secuencia no traducida Secuencia codificadora Normal 6-54 copies -4 Full Mutation 200+ 50-200 Repeats CGG

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Síndrome de X Frágil (SXF)

• El SXF es el síndrome genético más frecuente, causante de deficiencia mental hereditaria.
• Afecta principalmente a varones (la frecuencia del SXF es 1/5000 varones).
• Presentan un fenotipo característico.
• Es transmitido, fundamentalmente, por mujeres. La herencia de esta mutación es de tipo dominante ligada al cromosoma X.
• La mutación que origina el síndrome afecta a una región del cromosoma X, en la que se sitúa el gen FMR-1.
• Su nombre se debe a un estrechamiento del extremo distal del cromosoma X (Xq27.3), que aparecía en el cariotipo de los individuos afectados y que se denominó "sitio frágil".

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Expansión Anómala del Trinucleótido CGG

Síndrome de X Frágil

» Se produce una expansión anómala del trinucleótido compuesto por citosina-guanina-guanina (CGG) en el gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1), en una zona no codificante, situada al principio del gen (extremo 5') y que puede interferir en la transcripción y traducción de una proteína FMRP, localizada en el citoplasma celular, especialmente abundante en las neuronas.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Número de Repeticiones

Síndrome de X Frágil

» En los individuos normales el número de repeticiones de este triplete suele estar entre 6 y 50. » En los individuos afectados, la expansión es superior a 200 repeticiones (mutación completa), en este caso el gen se encuentra completamente inactivo. Ello provoca la ausencia de proteína FMRP. El déficit de esta proteína es la base del fenotipo típico del SXF.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Individuos Portadores

Síndrome de X Frágil

>> Los individuos portadores (denominados premutados) presentan entre 50 y 200 repeticiones del triplete CGG, en este caso el gen FMR1 no está lo suficientemente afectado como para producir un fenotipo típico. » La cantidad de proteína FMRP es menor, pero suficiente para que haya un desarrollo normal de las neuronas.

Proteí m Gen (CGG FMR 5-55 1 R na Z NOR® A MAL (CGG)5 PM JV5-200 (CGG) *

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Diagnóstico del SXF

Síndrome de X Frágil

• Aunque es poco frecuente, también se han descrito casos de SXF en los que los pacientes presentaban mutaciones puntuales o deleciones completas o parciales del gen FMR1, que también producían un déficit de la proteína.
• Para su diagnóstico se usan técnicas de PCR, análisis de fragmentos mediante EC (Electroforesis capilar) y SB (Southern Blot).

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Electroforesis Capilar en SXF

Síndrome de X Frágil

» Nos vamos a centrar en Electroforesis Capilar: Primero es necesario hacer PCR: Cuando el primers encuentra una expansión de triplete copiará un fragmento más grande, el cual se puede separar por tamaño y analizar por EC. Esto permite determinar que cuando un triplete se repite más del número de veces permitido, será causante de una enfermedad.

Discriminación Alélica por Tamaño: Southern Blot

Síndrome de X Frágil

DNA Blotted onto Nitrocellulose DNA Separated by Gel Electrophoresis Specific DNA Probe Detected Probe (on X-ray film) - Reveals DNA of Interest SOUTHERN BLOT 1 2 3 4 5 6 7 8 6.2 Kbp 5.2 Kbp 2.0 Kbp 2.8 Kbp 1

Discriminación Alélica por Tamaño: Análisis de Fragmentos

Síndrome de X Frágil

3 150 1% 200 110 140 E $30 240 35 960 . . . 2000 fear 1 TP-PCR

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Análisis de STRs

» El 10% del ADN nuclear codifica "que somos y cómo somos". De ese 10%, los seres humanos compartimos casi todo. » Si lo que queremos es algo que nos sirva para discriminar a unas personas de otras, el ADN codificante, nos va a servir de poco.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Polimorfismos y Marcadores de ADN

Análisis de STRs

» Dentro del ADN no codificante nos encontramos con zonas de una extraordinaria variabilidad de unas personas a otras, de ahí que las denominemos "polimorfismos". También, por el uso que le damos, los llamamos "marcadores" de ADN. » Hay distintos tipos de polimorfismos. Un tipo de polimorfismos de ADN muy utilizado, es conocido como "repeticiones cortas en tándem" (STR).

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Estructura de STRs

Análisis de STRs

» Un STR está formado por una secuencia corta de bases (2-6 pb) (por ejemplo, de cuatro, "GATA", que se repite un número determinado de veces ( ... GATAGATAGATAGATAGATAGATA ... ). » La secuencia "GATA" forma lo que denominamos la unidad de repetición. » Esta unidad de repetición "GATA" es igual para todas las personas; lo que varía de unas personas a otras, es el número de veces que se repite.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Alelos en STRs

Análisis de STRs

» Cada número de repeticiones concreto constituirá un "alelo", que es como denominamos a cada forma que puede tomar este sistema o marcador genético. » Si seguimos con nuestro ejemplo sobre STR, en la secuencia anterior, la unidad "GATA" se repite 6 veces. Estamos, pues, ante el alelo 6 de nuestro ejemplo. » Así, por ejemplo, el "alelo 6" presentará seis veces la secuencia GATA, GATA, GATA, GATA, GATA, GATA y en una población podrían existir los alelos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, etc.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Genotipo y Diferenciación Individual

Análisis de STRs

» Además cada persona tendrá, para cada sistema o marcador genético analizado, sus propios dos alelos, uno procedente del padre y otro procedente de la madre. » De esta manera el par de alelos o genotipo de una persona para cada marcador STR (p. ejem. 6/9), permite diferenciarlo o relacionarlo con otras personas.

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Definición de Secuencia STR

Análisis de STRs

» Por tanto, cada secuencia STR se define por el tipo de unidad repetida (lo más frecuente, di, tri o tetra, aunque también penta o hexa nucleótidos) y además por el sitio que ocupan en el genoma (locus). » Siguiendo con el ejemplo anterior, la secuencia GATA (tetranucleótido) se sitúa en D5S818 (locus) y, por ejemplo, para un determinado individuo esta secuencia se repite 6 y 9 veces (alelos 6/9, uno procedente del padre y otro de la madre).

Aplicaciones de Electroforesis Capilar: Ejemplos de STRs

Análisis de STRs

» Para su análisis se requiere separación de ADN basada en tamaño (por electroforesis) para distinguir un alelo del otro. » Ejemplos de STRs: dinucleótidos: (ca)(ca)(ca)(ca) trinucleotídos: (gcc)(gcc)(gcc) tetranucleótido (aatg)(aatg)(aatg) pentanucleótido (agaaa)(agaaa) hexanucleótido (agtaca)(agtaca)

Use PCR primers P1, P2 to amplify alleles in genomic DNA samples 40 bp Allele 1 = (CA) P2 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT P1 PCR product = 80 + 32 = 112 bp P2 Allole 2 = (CA) .. CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT DI PCR product = 80 + 28 = 108 bp Allole 3 - (CA) CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT 21 PCR product - 80 + 22 = 102 bp

P2 40 bpCategoría Ejemplo de Estructura de Repetición 13 Loci de CODIS Repeticiones Simples - contiene unidades de tamaño y secuencia idénticos (GATA)(GATA)(GATA) TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539 Repeticiones Simples con alelos sin consenso (e.g., TH01 9.3) (GATA)(GAT-)(GATA) TH01, D18S51, D7S820 Repeticiones Compuestas - abarca dos ó más repeticiones simples adyacentes (GATA)(GATA)(GACA) VWA, FGA, D3S1358, D8S1179 Repeticiones Complejas - contiene varios bloques de repeticiones de unidades de tamaño variables (GATA)(GACA)(CA)(CATA) D21S11

AL 1 2 3 15 - 14 13 - 12 STR 11 DSS818 10 1 9 8 7 Fig. 9.4. Electroforesis en gel de los productos amplifi- cados en una PCR para el STR D55818 de tres muestras correspondientes a tres individuos diferentes. AL: escalera alélica del STR D55818, del que se conocen 9 alelos (desde 7 hasta 15 repeticiones de la secuencia básica AGAT). El individuo 1 es heterocigoto para los alelos 11 y 12; el in- dividuo 2 es homocigoto para el alelo 10; el individuo 3 es heterocigoto para los alelos 12 y 15.