Biología molecular y citogenética: técnicas de hibridación con sonda

Técnica de hibridación de los ácidos nucleicos

Formación de moléculas bicatenarias (dúplex) con hebras de ácidos nucleicos de distinto origen

• En fase líquida -> Disoluciones
• In situ -> En lugar nativo
• En soporte sólido -> Matrices y membranas

ADN problema Sonda de secuencia conocida ADN problema desnaturalizado Hibridación del ADN problema con la sondaU

Marcaje con sondas

Isótopos radiactivos Se sintetizan con sustancias que contienen átomos que emiten radiaciones características

Fluorocromos Se unen a sustancias que emiten luz característica al recibir ciertas radiaciones

Haptenos Se unen a sustancias identificadas por anticuerpos

Segmentos de ADN o ARN cuya secuencia conocemos y que han sido marcados mediante enzimas, sustratos antigénicos, quimioluminiscencia (fluorocromos) o radioisótoposPonte a prueba

¿Qué tipo de marcadores crees que se han utilizado en la siguiente hibridación?

FLUOROCROMOS Wikimedia commons

Procedimiento de hibridación

1. Preparación de la muestra
2. Hibridación
3. Lavado
4. Detección

UU

Preparación de la muestra

Crear las condiciones necesarias para que los puentes de hidrógeno que unen las cadenas complementarias se rompan

Hibridación

Unión de ácido nucleico problema a las sondas

• Concentración de sonda
• Complementariedad de la sonda con el ADN/ARN diana
• Temperatura
• pH
• Concentración de sales
• Longitud de la cadena
• Composición de las cadenas implicadasU

Lavado

Eliminación de las sondas no unidas a los ácidos nucleicos

Detección

Localización de las sondas unidas

Hibridación in situ

La hibridación se realiza directamente sobre tejidos o células, tras lo que se adhieren a un soporte físico

FISH (Hibridación fluorescente in situ)

• Uso de fluorocromos
• Estudio cromosómico

3 V 2

Sondas

1. De locus específico (LSI)
2. Centroméricas
3. Subteloméricas
4. De pintado cromosómicoU

Protocolo de FISH

Preparación de la muestra

• Cultivo de células
• Sacrificio
• Obtención de material genético

Hibridación

Unión a sondas marcadas

Lavado y montaje

• Eliminación de sondas no unidas
• Montaje en medio físico por extensión

Aplicaciones de la FISH

Diagnóstico de enfermedades cromosómicas Diagnóstico prenatal Diagnóstico preimplantacional Enfermedades oncohematológicas .1. .28 .6.8 .8 .. @10mm @11#8U

Hibridación genómica comparada (CGH)

Escaneo del genoma completo de un individuo

CROMOSOMAS EN METAFASE + ADN PROBLEMA + ADN CONTROL

• Amarillo -> Zonas no afectadas (ambos ADN)
• Rojo -> Delecciones (solo ADN control)
• Verde -> Duplicaciones (más ADN problema)

ADN de la muestra Marcaje con fluorocromo verde Marcaje con fluorocromo rojo Zona normal Zona de delección Zona de duplicación Verde > Rojo Ratio verde-rojo Verde < Rojo Permite detectar ganancias o pérdidas de ADN, pero no su reordenamiento

Hibridación competitiva

1 10000 10000 Cromosomas con DAPI - ADN controlF

Array-CGH

Análisis y detección de secuencias de ADN mediante micromatrices

ADN problema Hibridación ADN control Solo en control Solo en problema En ambos Ausente en ambos Permite detectar presencia o ausencia de secuencias concretas y su cantidad

Transferencia (Blotting)

U Traslado desde geles de electroforesis a membranas para su estudio

• Southern -> ADN
• Northern -> ARN
• Western -> Proteínas

Permite detectar y trabajar más fácilmente con ADN separado

I I HI H I 11 11 11 ADN Fragmentación de ADN y separación por electroféresis Trasferencia a una membrana Incubación por sonda marcada que se une a fragmentos complementarios (hibridación) Revelado de la sonda. Indica que existe el fragmento I IU

Combinación de FISH con marcado inmunofenotípico

FICTION CD117 BCR-ABL CD34 BCR-ABL CD3 BCR-ABL TdT BCR ABL €

1. Selección de células tumorales mediante anticuerpos contra marcadores biológicos específicos.
2. FISH, para detectar y estudiar anomalías genéticas.UNIVERSAE CHANGE YOUR WAY