Unidad 1: Microscopía, microscopios ópticos y electrónicos

Microscopia

Pág. 22 a 33 de Cooper (según el índice)

Historia de la Microscopía

Desde Hooke hasta la Teoría celular

En 1665 Robert Hooke observó corcho con un microscopio óptico muy simple y pudo ver estructuras similares a cajas o celdas a las que llamó "células". Lo que en realidad vió fueron los de paredes celulares celulares del material vegetal secoFig: 6;

K Fig : 5 Microscopio utilizado por Robert Hooke

FIGURA 1.22 Estructura celular del corcho. Una reproducción de un dibujo de Robert Hooke de una lámina de corcho examinada con un microscopio óptico. Las «células» que Hooke observó fueron en realidad las paredes celulares que quedan cuando las células han muerto hace tiempo.

En 1670 Antony Leeuwenhoek, utilizando un microscopio que ampliaba 300 veces pudo observar diferentes células.En 1838 Mathias Schleiden y Theodor Schwann, tras realizar observaciones con microscopio óptico, propusieron la Teoría celular cuyos postulados son:

• Todos los seres vivos están formados por una o más células
• Toda célula se origina de otra célula preexistente
• La célula es la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos.

El Microscopio Óptico

Componentes del Microscopio Óptico

Los microscopios ópticos están formados por estructuras de tipo mecánico, un sistema de lentes y una fuente luminosa. En el sistema óptico están integrados 3 tipos de lentes: el condensador, el objetivo y el ocular.

LENTE OCULAR -ocular cabezal . TUBO TORNILLO MACROMÉTRICO portaobjetivos brazo REVÓLVER TORNILLO MICROMÉTRICO tornillo carro móvil objetivo platina LENTES OBJETIVO BRAZO PLATINA CONDENSADOR tornillos macrométrico micrométrico diafragma condensador ESPEJO tornillo condensador + base BASE O PIE Partes del microscopio ópticoOCULAR LENTE OBJETIVO ESPÉCIMEN PLATINA DIAFRAGMA CONDENSADOR CONTROLDE ENFOQUE (Macro y micrométrico) LUZ BASE Diagrama de un microscopio compuesto

Por el condensador pasa un haz de luz (producida por una lámpara y desviada generalmente por un espejo) que incide sobre el objeto que se quiere estudiar.

El objetivo aumenta la imagen de la pieza proyectándola sobre el ocular. Los objetivos son intercambiables de acuerdo al aumento que se necesite para ver un objeto determinado.

El ocular aumenta más la imagen del objeto y a su vez la proyecta sobre el ojo (o los ojos si es un microscopio binocular) de la persona que observa. Al igual que el objetivo los oculares también son intercambiables.Imagen Lente ocular € ·Imagen intermedia Objetivo Muestra Lente condensador Fuente de luz Marcha de rayos y formación de imágenes en un MO

OJO. LENTE OCULAR LENTE OBJETIVO ESPECIMEN LENTE CONDENSADOR LUZ Esquema de las vías de luz en un microscopio compuesto de campo brillanteEl microscopio óptico permite la visualización de detalles aumentados de la estructura celular.

La mayoría de las células tienen entre 1 y 100 um (micrometros) y pueden ser observadas por los microscopios ópticos, como también algunos orgánulos, pero no permite observar pequeños detalles de la estructura de las células dado su poder resolutivo.

Poder Resolutivo del Microscopio Óptico

Def .:

PODER RESOLUTIVO: Capacidad de un sistema óptico para ver detalles

Nota:

Unidades de medida útiles: 1 mm = 1000 um (um : micrómetro) 1 um = 1000 nm (nm : nanómetro) 1 nm = 10 Å (Å : Angstrom)

La difracción de la luz limita la resolución del microscopio hasta aproximadamente 0,2 um, esto significa que dos objetos separados por menos de esa distancia no se distinguen uno del otro y aparecen como una imagen única.

Nota:

Difracción: Desviación de ondas alrededor de las esquinas de un obstáculo o a través de la abertura.

11 Def .:

LÍMITE DE RESOLUCIÓN: Mínima distancia que debe existir entre 2 puntos para ser vistos como separados

El Límite de Resolución (LR) está definida por:La longitud de onda de la luz visible (1 ) y por el poder de captación de la luz de los lentes del microscopio (AN, amplitud numérica), de acuerdo a:

LÍMITE DE RESOLUCIÓN LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ 0.61 LR = APERTURA NUMÉRICA AN ( n . Sen a ) Indice de Refracción del Medio Semiangulo de Incidencia de la luz

Donde: AN = n sen « n = índice de refracción del medio a través del cual la luz viaja entre la muestra y la lente ( es la relación entre la velocidad de la luz en un determinado medio y la velocidad de la luz en el vacío) «= mitad del ancho del cono de luz recogido por el lente. El valor máximo que puede tomar es 90° (sen 90° =1)

Nota:

La refracción es el cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio a otro.1 Línea normal Rayo incidente n1 01 Superficie n2 Rayo refractado Lente del objetivo 8 Muestra Diapositiva Etapa Lente conden- sadora Luz FIGURA 1.23 Apertura numérica. La luz se enfoca en la muestra mediante la lente condensadora y se recoge en la lente del objetivo del microscopio. La apertura numérica está determinada por el ángulo del cono de la luz que entra en el objetivo de la lente (a) y por el índice de refracción del medio (normalmente agua o aceite) entre la lente y la muestra.BLANCA 500 nm AZUL 400 nm UV 200 nm . 0.61 LR = AN ( n . Sen a ) AIRE n=1 H20 n= 1.33 ACEITE n=1.52

Nota: 1000 nm 1 pm 500 nm 500 nmm x 1 pm / 1000 nm = 0,5 um

Cálculo del Aumento

CÁLCULO DEL AUMENTO: El aumento o magnificación se obtiene multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular.OCULAR LENTE OBJETIVO ESPÉCIMEN PLATINA DIAFRAGMA CONDENSADOR CONTROLDE ENFOQUE (Macro y micrométrico) LUZ BASE

Ejemplos: - Ocular (10X) y objetivo seco débil (10X): 10X * 10X = 100X - Ocular (10X)y objetivo seco fuerte (40X): 10X * 40X = 400X - Ocular (10X)y objetivo de inmersión (100X): 10X * 100X = 1000X

Tipos de Microscopios Ópticos según Iluminación

Tipos de microscopios ópticos según iluminación - Campo claro campo oscuro - Luz polarizada - Contraste de fase - Contraste diferencial de interferencia - Epifluorescencia - Confocal - Por excitación de dos fotones

Microscopio de Campo Oscuro

Microscopio de campo oscuro Se ilumina el objetivo de forma oblicua usando un condensador especial. sólo la luz que impacta oblicuamente entra al objetivo. Se emplea un objetivo de baja AM (<(1.1).A) Campo claro Objetivo Muestra Platina Condensador Control de diafragma Filtro de luz de día Fuente de iluminación B) Campo oscuro Objetivo Luz disp Muestra ers Platina at Condensador Filtro opaco Filtro luz de dia Fuente luminosa Borrelia -El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro. -Se ven contornos o bordes, no la estructura interna. -Se ven objetos que con campo claro no se ven por falta de contraste. -Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras que no se distinguen con el MO de campo claro. -Pueden visualizarse células vivas.

Microscopio de Contraste de Fase

Microscopio de contraste de faseConvierte la diferencia de fase en diferencia de intensidad (A) incident light (white) (B) incident light (green) waves in phase stained section of cell unstained cell waves out of phase TT Condenser annulus Condenser Specimen Objective O Phase plate . Direct (surround) light Diffracted light Phase Contrast Microscope Configuration Image Plane Digital -Camera System -Diffracted Light Direct (Surround) Light Observation Transmitted Light Biological Microscope Objective - L Specimen- Phase Plate Condenser- r Figure 1 Condenser Annulus Diafragma anular y placa de fase en el objetivo anillo transparente Imagen intermedia formada por interferencia de todos los rayos. Ventaja: estudio de células vivas . Permite estudios dinámicosCampo claro Contraste de fase (A) (B) (C) (D) 50 p.m Interferencia diferencial Campo oscuro Fibroblasto en cultivo

Microscopio de Luz Polarizada

Microscopio de luz polarizada Luz polarizada Polarizador y analizador Prismas de espato de Islandia o Nicol, Discos polaroid - Cuerpos isotrópicos o monorrefringentes - Cuerpos anisótropos o birrefringentes rayo ordinario rayo extraordinario polarizadoOCULAR VISTA CON LUZ POLARIZADA ANALIZAD (NÍCOLES CRUZADOS ANALIZADOR OBJETIVOS LÁMINA DELGADA PLATINA GIRATORIA RUEDAS ENFOQUE @ CONDENSADOR DIAFRAGMA Cristales de imidazolato observados con microspio de luz polarizada

Microscopio de Interferencia Diferencial (DIC)

Microscopio de interferencia diferencial (DIC)- Se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los rayos luminosos al atravesar un objeto transparente (diferencias de fase) como diferencias de intensidad o de coloración - Aspecto de relieve. - Utiliza luz blanca polarizada - Ventajas : las del microscopio de contraste de fase y se puede cuantificar el espesor del corte y cambios en el índice de refracción

Microscopio de Epifluorescencia

Microscopio de epifluorescencia Propiedades de la fluorescencia: Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.Ocular Filtro selector de longitud de onda De iluminación Filtro de longitud de onda emisión Fuente de luz Espejo Dicroico Objetivo Muestra con marca fluorescente Inmunofluorescencia con fluorocromos de distintos colores: Phalloidin CYP1A2 DAPI Merge Células marcadas con distintos anticuerpos10 um Mitosis: marcación de microtúbulos, cromosomas y filamentos de actina

Microscopio Confocal

Microscopio confocal (invertido) Laser de Argón-Kriptón Pinhole Lámpara luz convencional Laser ultravioleta Lámpara luz ultravioleta convencional Muestra Fotomultiplicadores Objetivo Ocular ASerrano 98 Permite observar una célula o tejido vivo en diferentes planos focales. Se observa el plano que está situado en el punto de foco del sistema óptico eliminando, de forma óptica a través de un diafragma o ""pinholepinhole", la luz proveniente ", la luz proveniente de los planos que están fuera de foco.