Prácticas de Bioquímica de la Universidad Alfonso X el Sabio

UNIVERSIDAD ALFONSO X EL SABIO

GRADO EN VETERINARIA

PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA CURSO 2024/25 PRIMER CUATRIMESTREWSNO: SA DIFF

NORMAS PARA EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. Es obligatoria la UTILIZACIÓN DE LA BATA DE LABORATORIO.
2. Sobre las mesas del laboratorio deben aparecer únicamente el material con el que se va a trabajar. Los abrigos, bolsos, libros, etc. deben situarse en las zonas dedicadas a tal fin.
3. Al finalizar la sesión práctica, el puesto de trabajo debe quedar LIMPIO, recogido y en perfectas condiciones de uso.
4. NO SE PERMITE la entrada al laboratorio con COMIDA o BEBIDA.
5. En el laboratorio se debe llevar el pelo recogido y se debe tener precaución con la llama de los mecheros.
6. En caso de accidentes, tales como roturas, derramamiento de cultivos, cortes, quemaduras, etc. deberá advertirse inmediatamente al profesor encargado del laboratorio, quien dará las instrucciones oportunas.
7. No debe arrojarse por la pila ni a la basura los cultivos y materiales con los que se ha trabajado, hasta que no hayan sido esterilizados. Deberán depositarse en los recipientes dispuestos a tal efecto.
8. Antes de salir del laboratorio es preciso lavarse las manos con agua y jabón, y aclararlas con una solución desinfectante.

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ESQUEMA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

DIA 1

• PRÁCTICA 1. Obtención de caseína de la leche.

DÍA 2

• PRÁCTICA 1. Valoración cuantitativa y electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS.

DÍA 3

• PRÁCTICA 1. Resultados de la electroforesis de la caseína.
• PRÁCTICA 2. Identificación de hidratos de carbono.

4º DÍA

• PRÁCTICA 3. Efecto de la concentración de enzima y de la temperatura en la actividad de la amilasa.

5º DÍA

• Examen.

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PRÁCTICA 1 OBTENCIÓN Y VALORACIÓN CUANTITATIVA DE LA CASEÍNA. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS

1. AISLAMIENTO DE LA CASEINA DE LA LECHE

FUNDAMENTO

La leche está formada por dos tipos de proteínas: las caseínas, que constituyen un 80% de la leche, y las proteínas del suero, entre las que se encuentran las lactoalbuminas y las inmunoglobulinas (entre ellas la ß-lactoglobulina), que representan un 20%. La caseína es una fosfoproteína con un punto isoeléctrico de 4,7. Esta proteína está fosforilada mediante un enlace ester en una serina o treonina. Comprende varios tipos de moléculas, de los cuales el 50% son a-caseína, el 30% ß-caseína, el 15% k-caseína y el 5% y-caseína. Los pesos moleculares de las caseínas en estado de monómeros están próximos a 25.000 dalton. En su estado nativo se encuentran siempre fuertemente asociadas entre ellas, formando micelas relativamente grandes y mineralizadas, de peso molecular próximo a 3x109.

PESOS MOLECULARES

216 KD 132 kD 78 kD 45,7 kD 32,5 kD

CASEINAS

18,5 kD 7,6 kD 3,8 kD Las caseínas a, B y y pueden agregarse mediante iones de calcio, pero la caseína k es muy resistente a esta agregación. Por ello la K-caseína sirve como un coloide protector que preserva a las micelas de caseína de la agregación que daría a la leche una consistencia parecida al requesón. En la elaboración de queso se añade a la leche el enzima renina para provocar la formación de la cuajada, el enzima separa de la K -caseína un péptido que Universidad Alfonso X el Sabio 4X OSN SIVUM SNOST DIFFU contiene ácido siálico para, de este modo desestabilizar las micelas de caseína y obtener la formación de cuajadas. Una vez extraído el suero o porción acuosa resultante, la cuajada puede utilizarse para hacer queso. La ß-lactoglobulina contiene una proporción relativamente alta de aminoácido cisteína, que lleva un grupo SH. Cuando se calienta la leche, estos grupos se desprenden de la proteína como sulfuro de hidrógeno, esta es la fuente del aroma característico de la leche hervida.

OBJETIVO

En esta práctica aislaremos la caseína a partir de una muestra de leche mediante una precipitación isoeléctrica. La solubilidad de la mayoría de las proteínas globulares se halla profundamente influida por el pH del sistema. El pH al que una proteína muestra menos solubilidad es el que corresponde a su punto isoeléctrico (pI), definido como el valor de pH al que una molécula no posee carga eléctrica (se iguala el número de cargas positivas y negativas) y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. Si el pH se halla por encima del pI, la proteína posee una carga negativa neta. Esta carga será positiva cuando el pH sea inferior al pI. De esta manera, variando el pH de una mezcla de proteínas y ajustándolo al pI de uno de sus componentes, podemos provocar la precipitación de esta proteína, quedando en disolución otras proteínas cuyos valores de pI se hallen por encima o debajo del pH. La precipitación se produce porque todas las moléculas de esta proteína no tienen carga eléctrica y por tanto no existe repulsión electrostática entre moléculas de esta proteína y otras proteínas vecinas, por lo que se vuelve insoluble y precipita. La proteína así precipitada permanece en su conformación nativa y puede redisolverse en un medio con pH y concentración salina adecuados.

MATERIAL Y REACTIVOS

• Leche desnatada.
• Ácido acético 10%.
• Agua destilada.
• Alcohol 950.
• Éter dietílico.
• PBS.
• Filtro de papel.
• Embudo.
• Matraz de 50 ml.
• Vaso de precipitado de 50 ml.
• Espátula.
• Pipetas Pasteur.
• Pipeta de 5 ml.
• Probeta de 50 ml.

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MÉTODO

1. Mezclar 15 ml de agua destilada + 5 ml de leche.
2. Calentar la mezcla a 38º C.
3. Añadir ácido acético 10% hasta que el pH sea 4,5-4,7 (punto isoeléctrico de la caseína).
4. Incubar 10 minutos en hielo para favorecer la precipitación.
5. Filtrar. La caseína precipitada quedará retenida en el filtro.
6. Lavar con agua: añadir unos 3 ml de agua destilada. Resuspender con una pipeta pasteur en el filtro y esperar a que el líquido decante.
7. Lavar con etanol 95° (3 ml). Filtrar.
8. Lavar con eter (3 ml). Filtrar.
9. Secar el precipitado a temperatura ambiente.
10. Pasar la caseína precipitada de filtro a un tubo eppendorf con una espátula.
11. Resuspender parte del precipitado proteico en 1 ml de tampón PBS.
12. Centrifugar 2 minutos a 3000 r.p.m.
13. A partir del sobrenadante, realizar el siguiente banco de diluciones: 100 ul SB Tirar 100 ul 900 ul H2O 10-1 10-2 10-3

2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

FUNDAMENTO

Los ensayos más comunes para cuantificar la cantidad de proteínas se basan en la adición de un agente químico a la muestra de proteínas que va a producir un efecto visual, como por ejemplo el cambio de color de la muestra. Este cambio de color puede medirse en un espectofotómetro o un lector de placas. Posteriormente se compara con una curva patrón de concentraciones conocidas de una proteína estándar. La cantidad de proteína de la muestra problema puede interpolarse en la curva patrón conociendo su absorbancia. Hay varios métodos para cuantificar la cantidad de proteína, cada uno con sus ventajas y desventajas. El método utilizado depende del tipo y cantidad de proteína disponible. Destacan dos: el Método de Lowry y el Método de Bradford.

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Método de Bradford

El Bradford es un ensayo colorimetrico para medir la concentración total de proteína. Se basa en el cambio de color del reactivo Coomasie brilliant blue G-250 en respuesta a las distintas concentraciones de proteína. El colorante se une principalmente a residuos básicos (sobre todo arginina) y aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). El ensayo es útil para medir proteínas y polipéptidos con pesos moleculares superiores a 3.000-5.000 daltons, dependiendo de los grupos cargados. El ensayo es válido para muestras de proteínas con una concentración menor a 25 µg/ml (1- 20 µg/ml). Este método es muy sensible a la presencia de detergentes y tampones debido a las interacciones entre estos compuestos y la proteína y/o estos compuestos y el colorante. En esta práctica utilizaremos el método de Bradford.

MÉTODO

Preparación de las muestras patrón

A partir de una solución madre de albúmina bovina sérica (BSA) en agua destilada a una concentración de 1 mg/ml, preparar los siguientes tubos:

TUBO 1 (Vf=1ml) [ ]=5 µg/ml Añadir: 1. 795 ul H2O c s.p. 2. 5 ul (5 µg) BSA 3. 200 ul reactivo Bradford

TUBO 2 (Vf=1ml) [ ]=10 µg/ml Añadir: 1. 790 ul H2O c.s.p. 2. 10 ul (10 µg) BSA 3. 200 ul reactivo Bradford

TUBO 3 (Vf=1ml) [ ]= 15 µg/ml Añadir: 1. 785 ul H2O c.s.p. 2. 15 ul (15 µg) BSA 3. 200 ul reactivo Bradford

TUBO 4 (Vf=1ml) [ ]= 20 µg/ml Añadir: 1. 780 ul H2O c.s.p. 2. 20 μl (20 μg) BSA 3. 200 ul reactivo Bradford

Agitar los tubos y dejar incubar a temperatura ambiente 10 min.

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Preparación de las muestras problema

1. Se toman los tubos con los 900 ul de las diluciones de la muestra de caseína (banco de diluciones) y se añade a cada uno 225 ul de reactivo de Bradford.
2. Se agitan y se dejan incubar a temperatura ambiente 10 min.
3. Se mide la absorbancia a 595 nm.

Lectura espectrofotométrica

1. Se toma el volumen total de la muestra (1 ml) y se introduce en una cubeta de espectrofotómetro.
2. Se lee la absorbancia a 595 nm. Esta longitud de onda es la óptima para el compuesto coloreado que se ha formado.

NOTA: El aparato se debe calibrar utilizando un blanco con 800 ul H2O y 200 ul reactivo Bradford.

Valores de absorbancia de la curva patrón

Concentración Absorbancia Tubo 1: 5 µg/ml Tubo 2: 10 μg/ml Tubo 3: 15 µg/ml Tubo 4: 20 µg/ml

Valores de absorbancia de las muestras problema

Dilución Absorbancia 10-3 10-2 10-1

Relación entre absorbancia y concentración. Ley de Lambert-Beer

La determinación cuantitativa de las proteínas existentes en una solución utilizando métodos colorimétricos se basa en la proporcionalidad existente entre el valor de la absorbancia (A) del complejo coloreado procedente de la reacción de las proteínas con un reactivo determinado (en nuestro caso reactivo de Bradford) y la concentración (C) en la que estas se encuentran en la solución. Dicha proporcionalidad se rige por la ley de Lambert-Beer. Entonces: A = Cx K K: Constante de proporcionalidad.

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