Ciclo di Krebs: funzione metabolica e ruolo anfibolico in Biologia

Università San Raffaele Roma

Docente Sara Baldelli

Lezione Ciclo di KrebsU Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Introduzione al Ciclo di Krebs

Il ciclo di krebs è anche chiamato ciclo degli acidi tricarbossilici e utilizza come metabolita di partenza l'acetil coezima A, che si ottiene per azione della piruvato deidrogenasi sul piruvato prodotto dalla glicolisi. Ciclo di Krebs 2 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Introduzione al Ciclo di Krebs e potere riducente

Dal Ciclo di Krebs si ottengono ATP e potere riducente; il potere riducente viene inviato alla catena respiratoria dove NADH e FADH, vengono ossidati rispettivamente a NAD+ e FAD: il potere riducente viene ceduto, lungo la catena respiratoria, a dei sistemi di accoppiamento dai quali viene prodotto ulteriore ATP. Ciclo di Krebs 3 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Introduzione al Ciclo di Krebs e metabolismo

ll ciclo di krebs è un punto nevralgico non solo per il metabolismo del glucosio ma anche per il metabolismo degli acidi grassi e degli amminoacidi, infatti il piruvato che viene convertito ad acetil coenzima A non proviene solo dalla degradazione del glucosio: si ottiene, ad esempio, anche dalla transaminazione dell'alanina (un amminoacido).

Metabolismo: Proteine, Glucidi, Lipidi

PROTEINE GLUCIDI LIPIDI amminoacidi glucosio glicerolo acidi grassi NH, NH, fotosintesi glicolisi acido piruvico acetil-CoA ciclo di Krebs catena di trasporto degli elettroni Ciclo di Krebs 4 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Ciclo di Krebs: Che cosa è

Che cosa è: è via metabolica che ossida i residui acetilici (CH3-CO-) ad anidride carbonica (CO2), trasferendo gli equivalenti riducenti al NAD+ o al FAD+. Avviene in presenza di Ossigeno (aerobiosi). Sede: matrice mitocondriale. Respirazione aerobica Cilesal ciclo di Krebs Matrice TARPONTO ELETTROME . POMPAGGIO Cintia BOITESI IF ATF Ciclo di Krebs 5 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Ciclo di Krebs: processo anfibolico

• Processo enzimatico che ossida (catabolismo) substrati provenienti da varie tappe metaboliche cellulari (piruvato, acetil-CoA, etc)
• Processo enzimatico che fornisce importanti precursori per vie anaboliche ( biosintesi del glucosio, degli aminoacidi, delle porfirine)

Ciclo di Krebs 6 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Enzymologia 4, 148-156

Acetyl-CoA e Condensation

Acetyl-CoA 1 Condensation CH3-C-S-CoA H2O CoA-SH citrate synthase CH2-COO" 0=C-Coo" HO-C-COO" 2a 8 CH2-COO" CH2-COO" Dehydration Oxaloacetate Citrate +H20 malate - dehydrogenase Citric acid cycle CH 2-C00" C-coo" cis-Aconitate C-coo" 7 H - H2O Hydration fumarase NADH aconitase H20 Hydration ÇOo" CH2-COO" Fumarate CH FADH2 Isocitrate HČ HO-C-H Čoo" isocitrate COO" dehydrogenase 3 succinate dehydrogenase Oxidative decarboxylation Dehydrogenation CH2-COO" CO2 CH2 succinyl-CoA synthetase CH2-COO" Coo- C=0 «-Ketoglutarate Succinate CH2 Coo" CoA-SH C-S-CoA CoA-SH GTP (ATP) CO2 4 5 Oxidative decarboxylation Substrate-level phosphorylation Ciclo di Krebs 7 di 30 Localizzazione intracellulare: Mitocondri (eucarioti) Citosol (procarioti) GDP O (ADP) + P Succinyl-CoA 6 a-ketoglutarate CH2-COO" dehydrogenase CH2 complex H-(-coo" HO-CH Malate CH2 Čoo" 2b aconitase Coo" DehydrogenationU Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Ciclo di Krebs: le tappe

Tappa 1: Carbonio metilico dell'acetil coenzima A

1. Il carbonio metilico dell'acetil coenzima A cede volentieri (per tautomeria) un protone (diventa un carboanione) e attacca il carbonio carbonilico dell'ossalacetato: si forma un tioestere ad alto contenuto energetico (il citril coenzima A) dal quale, per idrolisi, si ottiene il citrato e si riforma il coenzima A, tutto ad opera della citrato sintasi. CH3-C=0 H2O CoA-SH + 0=C-COO- S-CoA CH2-COO" citrate synthase Acetyl-CoA Oxaloacetate O CH2-C o HO-C-COO 1 CH2-COO- Citrate AG'º = - 32.2 KJ/mol Ciclo di Krebs 8 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 2: Conversione del citrato in isocitrato

2. Il citrato viene convertito in isocitrato per azione dell'enzima aconitasi; il nome dell'enzima deriva dal fatto che il citrato viene prima disidratato con formazione del cis-aconitato e, successivamente, l'acqua rientra attaccandosi ad un carbonio diverso da quello su cui era legato prima. Si ottiene l'isocitrato senza che il substrato lasci il sito catalitico. CH2-COO- H20 CH2-COO" Ć-coo- H2O HO-C-COO- aconitase ǁ I H C-COO- H Citrate cis-Aconitate CH2-COO H -- C-COO" HO-C-H coo- AG'º = 13.3 KJ/mol Isocitrate Isomerizzazione - Passaggio da un gruppo alcolico terziario ad un gruppo alcolico secondario più facilmente ossidabile Reazione stereospecifica: dei quattro possibili diastereoisomeri dell' isocitrato ne viene prodotto solo uno. Ciclo di Krebs 9 di 30 aconitase H-C-COO-U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Aconitasi e Fluoroacetato

L'aconitasi è il bersaglio dell' azione tossica del Fluoroacetato, composto di origine vegetale che è stato usato come veleno per topi. CoA-SH F-CH2-COO- Fluoroacetato F-CH2-CO-S-CoA Fluorocitrato Fluoroacetil-CoA Il fluoroacetato è un esempio di substrato suicida: viene trasformato in fluoroacetil-CoA, che funge da substrato per la citrato sintasi. Il fluorocitrato non può però essere trasformato dall' aconitasi. Il risultato è il blocco del ciclo dell'acido citrico Ciclo di Krebs 10 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 3: Perdita di un carbonio come anidride carbonica

3. Primo corrispettivo energetico perché si ha la perdita di un carbonio eliminato come anidride carbonica. L'enzima che catalizza questo stadio è la isocitrato deidrogenasi; il substrato subisce, innanzitutto, una deidrogenazione: il NAD+ acquista potere riducente e si forma ossalosuccinato (è un ossal derivato dell'acido succinico). L'ossalosuccinato subisce, poi, la decarbossilazione ad a-chetoglutarato. Prima decarbossilazione ossidativa del ciclo COO" COO" COO" coo" 1 CH2 NAD(P)+ NAD(P)H +H+ CH2 CH2 1 O H-C-C H-CTC H-C/ + H-C-H HO-C-H isocitrate dehydrogenase C-0 C C=0 1 Mn 2+ C C O O O O O O Isocitrate Oxalosuccinate a-Ketoglutarate Deidrogenazione a ossalosuccinato, un intermedio instabile legato all' enzima che subisce decarbossilazione spontanea prima del rilascio del prodotto Esistono due forme isoenzimatiche sia NAD+ che NADP+ dipendenti Ciclo di Krebs 11 di 30 O CO2 1 PH + 2 3 1 I C C Mn2+ CH2U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 4: a-cheto glutarato deidrogenasi

4. a-cheto glutarato deidrogenasi: L'attacco da parte della tiamina pirofosfato sul carbonile (C=O) dell'a- chetoglutarato, porta alla sua decarbossilazione e si ha la formazione del carbossi idrossi propil derivato. Con il successivo trasferimento sulla lipoamide, si verifica un processo ossidoriduttivo interno, dal quale si ottiene il carbossiderivato della lipoamide ossia la succinil lipoamide. Seconda decarbossilazione ossidativa del ciclo COO COO 1 CH2 CoASH CO2 CH2 C=0 C=0 - - COO NAD+ NADH + H+ S-CoA «-Chetoglutarato Succinil-COA AG'º = - 33.5 KJ/mol 1 CH2 CH2 - La reazione è catalizzata dal complesso a-chetoglutarato deidrogenasi, molto simile alla piruvato deidrogenasi sia nella struttura che nel meccanismo d'azione. Ciclo di Krebs 12 di 30U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 4 (continuazione): Succinil lipoamide e coenzima A

4. La succinil lipoamide reagisce, poi, con il coenzima A per dare il succinil coenzima A (che prosegue nel ciclo di krebs) e la lipoamide ridotta che viene riossidata dal FAD: il FADH2 che si è formato, viene riossidato dal NAD+ e si ottiene NADH. In questa tappa si è, quindi, verificata la seconda eliminazione di un carbonio dallo scheletro carbonioso, sotto forma di anidride carbonica. Seconda decarbossilazione ossidativa del ciclo COO- 1 CH2 1 CH2 CoASH CO2 CH2 C=0 C=0 - NAD+ NADH + H+ S-CoA «-Chetoglutarato Succinil-COA AG'º = - 33.5 KJ/mol La reazione è catalizzata dal complesso a-chetoglutarato deidrogenasi, molto simile alla piruvato deidrogenasi sia nella struttura che nel meccanismo d'azione. Ciclo di Krebs 13 di 30 COO CH2U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 5: Succinil coenzima A e succinil tiochinasi

5. Il succinil coenzima A viene sottoposto all'azione della succinil tiochinasi: il succinil coenzima A viene attaccato dall'azoto di una istidina (Hys) dell'enzima: si libera coenzima A e si forma, come intermedio, un addotto derivato dall'istidina cioè il succinil-enzima (o succinil-Hys); su questo intermedio agisce un ortofosfato, portando alla liberazione del succinato e alla formazione del fosfoenzima, liberando GTP. Fosforilazione a livello del substrato CH2-COO- - GDP + Pi GTP CoA-SH CH2 C-S-CoA succinyl-CoA synthetase - coo- Succinyl-CoA Succinate AG'º = - 2.9 KJ/mol Le cellule animali hanno due isozimi, uno specifico per ADP e un altro per GDP Il GTP formato può donare il gruppo yPi ad ADP mediante una reazione reversibile catalizzata dalla nucleoside difosfato chinasi GTP + ADP z ≥ GDP + ATP AG' º = 0 KJ/mole Il risultato netto dell'attività di entrambi gli isozimi della succinil-CoA sintetasi è la conservazione di energia sotto forma di ATP Ciclo di Krebs 14 di 30 COO- CH2 1 CH2 ÖU Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 6: Formazione del fumarato

6. Formazione del fumarato per azione della succinato deidrogenasi; questo enzima dà una reazione stereospecifica in quanto si forma sempre l'insaturo (è un alchene) trans ossia il fumarato (mentre l'isomero cis è il maleato). COO- FAD FAD H2 H COO- CH2 C CH2 = COO- succinate dehydrogenase -OOC H Succinate Fumarate AG'º = 0 KJ/mol Negli eucarioti l'enzima è legato alla membrana interna dei mitocondri (nei procarioti è associato alla membrana plasmatica) Contiene tre centri ferro-zolfo e una molecola di FAD legata covalentemente Gli elettroni estratti dal succinato passano attraverso FAD ed i centri ferro-zolfo prima di entrare nella catena di trasporto degli elettroni La succinato deidrogenasi catalizza la rimozione di 2 atomi di H dalla molecola di succinato Ciclo di Krebs 15 di 30 -U Università San Raffaele Roma Sara Baldelli

Tappa 7: Fumarasi e L-malato

7. Fumarasi: si addiziona acqua in maniera stereospecifica per fare L- malato. H COO- - '℃ .C H Fumarate Carbanion transition state -H+ fumarase H COO- H-C I H AG'º = - 3.8 KJ/mol Malate La fumarasi (fumarato idratasi) è altamente stereospecifica: catalizza l'idratazione del doppio legame trans del fumarato, ma non quella dell' isomero cis, il maleato. Nella direzione inversa (da L-malato a fumarato) la fumarasi è ugualmente stereospecifica: il D-malato non è substrato dell' enzima H COO" H COO- C C ooc H H coo Fumarate Maleate COO- COO- 1 HO-C-H Ī CH 2 1 coo" H-C-OH CH2 coo- L-Malate D-Malate Viene utilizzata una molecola di H2O per aggiungere un gruppo Ossidrile sul C2 e un H sul C3 trasformando il fumarato in malato H COO- OH" U- .C-OH fumarase -Ooc H C Ciclo di Krebs 16 di 30