Biochimica e biologia molecolare clinica, Lezione 4, 18/05/2023

Tecniche di indagine biochimiche

Per quanto riguarda le tecniche di diagnostica usate nel laboratorio clinico, si affronteranno prevalentemente quelle che indagano metaboliti e proteine e, in misura minore, quelle per gli acidi nucleici (elettroforesi). Delle tecniche che utilizzano le reazioni antigene-anticorpo, cioè i metodi biologici, si ragionerà sul Western Blot, senza soffermarsi su ELISA e sulle altre tecniche immunometriche. Nell'ambito dei metodi che utilizzano gli acidi nucleici per la diagnostica molecolare, sono stati trattati:

• PCR, essa può essere utilizzata in vari modi, ad esempio, con l'uso di sonde per fare una PCR real time; utilizzando primer modificati per evidenziare una variante allelica di una specifica mutazione oppure usandola nella preparazione di tante copie di una porzione di DNA da sottoporre a sequenziamento (di prima o di seconda generazione);
• Sequenziamento del DNA, consente di identificare eventuali variazioni in questa sequenza, tuttavia nei casi in cui le alterazioni genetiche sono molto estese non è possibile evidenziarle con il sequenziamento e si utilizzano altre metodologie;
• FISH, ibridazione in situ, con sonde fluorescenti, viene utilizzata se si conosce il punto esatto in cui si colloca la mutazione;
• CGH, comparative genomic hybridization o cariotipo molecolare, indaga l'intero genoma nel caso in cui non si conosca la localizzazione della mutazione. Questa tecnica consente di evidenziare delezioni, inserzioni, duplicazioni di DNA, ma non SNPs o inserzioni/delezioni di poche basi.

Per analizzare in toto le variazioni del genoma ed eventualmente le alterazioni complesse presenti nelle cellule e associate a una malattia, bisognerebbe utilizzare il single cell sequencing per analizzare la struttura di lunghe sequenze di DNA senza il bias delle precedenti amplificazioni e ricostruzioni.

• Analisi di espressione di mRNA, forniscono informazioni sulla diversa espressione nei tipi cellulari. L'RNA è più problematico dal punto di vista quantitativo in quanto è un materiale labile già nelle cellule e con i processamenti diventa problematico mantenere il suo profilo di espressione.

Alcuni RNA restano utili in diagnostica quando derivano da particolari alterazioni genetiche, come le trasmutazioni, che generano trascritti di fusione caratteristici di una determinata malattia (marker). Infine, esistono gli RNA non codificanti, ancora legati al campo della ricerca, che potrebbero rivelarsi utili per comprendere la patogenesi delle malattie e per estrarre biomarkers (nel momento in cui i geni codificanti proteine sono di poco aiuto).

Spettroscopia e radiazioni

Spostandosi dallo studio prettamente degli acidi nucleici (biologia molecolare clinica) allo studio in senso lato della biochimica clinica, si ricordano le analisi spettroscopiche. La spettroscopia raggruppa quelle tecniche basate sull'interazione tra radiazione elettromagnetica e materia. Si possono analizzare gli atomi, le molecole e le loro interazioni con lo spettro elettromagnetico, cioè l'assorbimento, l'emissione, la fluorescenza, la diffrazione e la polarizzazione. Queste metodologie vengono utilizzate nel laboratorio analisi per monitorare diversi markers.

In ambito di ricerca, queste tecniche consentono di:

• ottenere informazioni sulla struttura e sulla funzione delle molecole, studiando i loro aspetti di assorbimento e/o emissione (ad esempio proteine);
• effettuare un'analisi quantitative basata sulla valutazione dell'intensità di assorbimento/emissione di una radiazione elettromagnetica, da qui si valuta quanto analita è presente.

Lo spettro elettromagnetico ha radiazioni caratterizzate da lunghezze d'onda e frequenze. Queste due grandezze sono inversamente correlate, all'aumentare della frequenza si accompagna una riduzione della lunghezza d'onda e viceversa. Per lunghezze d'onda sempre maggiori, l'energia portata dall'onda sarà minore. Invece, nel caso di lunghezze d'onda minori, l'energia delle radiazioni sarà maggiore. Più la radiazione ha una lunghezza d'onda piccola (e frequenza elevata), più interagirà con oggetti piccoli. Dal visibile all'ultravioletto e fino a raggi x e y si interagirà con oggetti sempre più microscopici fino a evidenziare le macromolecole. Con radiazioni ancora più intense, sarà possibile agire sui legami chimici delle molecole e sui nuclei degli atomi. L'interazione tra materia e onda elettromagnetica valuta i quanti di energia che agiscono sugli elettroni nei nuclei, ogni elettrone è in grado di assorbire un determinato livello di energia (energia quantizzata) a una particolare frequenza e lunghezza d'onda. Acquisendo questa energia, l'elettrone si trova in uno stato eccitato e, tornando al suo stato energetico fondamentale, emette una radiazione con una frequenza minore e una lunghezza d'onda maggiore rispetto a quella assorbita. Le onde radio hanno lunghezze d'onda così alte da non consentire di misurare molecole biologiche, mentre le microonde e gli infrarossi sono utilizzati in ambito fisico e, invece, il visibile e l'ultravioletto in biochimica clinica. Esistono anche raggi x e y che interagiscono con i nuclei atomici. Ad esempio, con i raggi x nell'imaging si osservano porzioni solide dell'organismo.

Tecniche spettroscopiche e risonanza magnetica

Le onde radio hanno lunghezze d'onda così alte da non consentire la misurazione delle molecole biologiche, ma possono essere applicate in medicina nell'ambito della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica valuta l'emissione di radiazioni misurabili dagli elettroni al ritorno al loro stato naturale, più difficilmente l'emissione dei protoni (H+). Si osserva l'orientamento degli elettroni in un campo magnetico sulla base del loro spin. Nella risonanza, infatti, il paziente sdraiato sul lettino è inserito in un tubo nel quale è stato creato un campo magnetico unidirezionale che può esser fatto ruotare e che devia lo spin degli elettroni. L'aggettivo nucleare associato alla risonanza magnetica indica che è possibile la distinzione degli atomi sulla base del nucleo, ma non va direttamente a interagire con esso. La risonanza magnetica permette l'osservazione di tessuti molli ed è particolarmente utilizzata per l'osservazione del SNC. Precessione: fenomeno che si osserva in qualsiasi oggetto che ha un asse che ruota, anche nella Terra. Ad esempio, quando una trottola gira all'inizio è quasi perpendicolare alla superficie, rallentando oscilla su un'orbita e questa oscillazione è chiamata precessione. Quest'ultima è riscontrabile anche nell'elettrone, sottoposto a un campo magnetico, che ruota.

Tipi di spettroscopia

Le tecniche spettroscopiche

• Spettroscopia delle microonde sfrutta le transizioni dovute all'energia rotazionale delle molecole e viene utilizzata in fisica nucleare, meteorologia e radioastronomia.
• Spettroscopia IR sfrutta le transizioni vibrazionali associate alla radiazione infrarossa. L'energia vibrazionale è anch'essa quantizzata ed è dovuta alle vibrazioni a cui sono soggetti gli atomi nelle molecole. Tali vibrazioni interessano sia gli assi di legame sia gli angoli di legame. Questa tecnica è utilizzata nel campo della chimica analitica e della caratterizzazione dei materiali, oltre che in chimica fisica per lo studio dei legami chimici.
• Spettroscopia ultravioletto-visibile analizza le radiazioni associate alle transizioni energetiche degli elettroni di legame.
• Spettroscopia di assorbimento dei raggi x e la loro diffrazione vengono utilizzate per determinare la struttura tridimensionale delle proteine in medicina nucleare.
• Spettroscopia di assorbimento a raggi y viene utilizzata per studiare la struttura nucleare, lo stato di valenza, lo spin e la geometria di coordinazione di un atomo.

Oltre che essere utilizzati in medicina nucleare, i raggi x e y vengono sfruttati anche per sterilizzare componenti chirurgici in ambito biomedico. Per misurare gli analiti o i biomarkers che danno informazioni per la diagnosi e per capire l'andamento di una terapia, è ottimale utilizzare le radiazioni del visibile o dell'ultravioletto. Queste radiazioni sono utilizzabili a temperatura ambiente, non devono essere mantenute da lampade a sottovuoto e sono abbastanza resistenti da essere utilizzabili in tutti i laboratori analisi. La materia può assorbire questo tipo di radiazioni quando presenta dei doppi legami ( dalla chimica organica, si ricorda che un doppio legame è un legame ibrido formato da un legame o e uno I). Quando viene assorbita una determinata radiazione in grado di entrare in risonanza con questi legami, si ha il passaggio a uno stato di eccitazione. Dal punto di vista energetico, si passa transitoriamente a un orbitale di legame più elevato. Questo passaggio, assorbendo energia, fa abbassare l'intensità della lunghezza d'onda che si sta fornendo alla sostanza.

Cromofori e analisi spettrofotometriche

Quanta energia è richiesta per compiere questi passaggi? Dipende dalle molecole con cui si va a interagire. Quando sono presenti molecole con un doppietto di elettroni non condiviso (come nell'azoto o nell'ossigeno) ed è anche presente un legame doppio It, spesso coniugato, sono richieste radiazioni con un'energia non molto elevata e, quindi, una lunghezza d'onda prossima o all'UV vicino o al visibile (200-600 nm). Le parti di molecole con queste caratteristiche, sono definite cromofore perché appaiono colorate in seguito all'assorbimento della radiazione. Esempio: se la borraccia è rossa, è perché sta assorbendo della luce visibile e in particolare tutte le lunghezze d'onda tranne quella della luce rossa.

I cromofori

I cromofori sono strutture molecolari con doppi legami, spesso coniugati ed eventualmente "legate" a metalli. Sono responsabili delle transizioni e dell'assorbimento di radiazioni del vicino UV e del visibile delle molecole organiche. Nelle proteine esistono almeno tre tipi di cromofori rilevanti per la spettroscopia UV/VIS

• legami peptidici
• alcune catene laterali amminoacidiche, contenenti triptofano e tirosina che assorbono in maniera ottimale a 280 nm
• gruppi prostetici e coenzimi (gruppo eme, citocromi NAD(P)H .. )

Analisi spettrofotometriche e colorimetriche

Molte molecole biologiche assorbono radiazioni UV e possono essere misurate con tecniche spettrofotometriche. Alcune molecole biologiche sono colorate (es. beta-carotene), assorbono cioè luce visibile, e possono perciò essere misurate con tecniche colorimetriche (utilizzano la luce visibile). Altre molecole sono prive di colore, ma possono essere convertite in composti colorati mediante reazioni cromogene (che formano colore) adatti all'analisi colorimetrica. Le analisi spettrofotometriche e colorimetriche richiedono strumentazioni relativamente semplici e sono comunemente utilizzate per l'analisi quantitativa delle molecole biologiche. In queste analisi è importante capire quale lunghezza d'onda utilizzare in base al profilo di assorbimento e di emissione della sostanza:

• Le v/2 di luce (energia elettromagnetica) assorbite da una molecola dipendono dalla sua struttura e quindi sono caratteristiche della molecola stessa.
• Nell'analisi colorimetrica e spettrofotometrica occorre conoscere ed utilizzare la v/2 della luce più adatta all'analisi.