Maturazione degli RNA: processi in procarioti ed eucarioti

Maturazione degli RNA

La trascrizione non produce generalmente RNA funzionali, ma molecole di
precursore che potranno esercitare la loro attività solo dopo aver subito una serie di
processi di maturazione che includono:
· tagli nucleolitici e modificazioni chimiche dell'RNA;
· modificazioni delle sequenze nucleotidiche mediante "splicing" e "editing"
Vedremo:
· Processamento degli rRNA (procarioti e eucarioti)
· Processamento dei tRNA (procarioti e eucarioti)
· Ribozimi autocatalitici a "testa di martello"
· Modificazioni chimiche delle basi e del ribosio
· Aggiunta "cap" a mRNA eucariotici
· Poliadenilazione e terminazione trascrizione mRNA eucarioti

rDNA clusters

Cytoplasm
NCL1
Nucleolus
47S pre-rRNA
NPMI
Nucleus
1
V
Processing
18S
5.8S
28S
Assembly
Pre-60S
RPL
Pre-40S
RPS
Export
Export
N
tRNA
Polypeptide
GTP
80S ribosome
MA AAAAA
Pre-40S
Pre-43S
elF2
5'm7GTP-cap
mRNA
elF3
eIF4E
Protein synthesis
rRNA
Processing
In
Prokaryotes
&
Eukaryotes
3
Transcription
n
5S RNA

Processamento rRNA (procarioti ed eucarioti)

I geni rRNA sono trascritti sotto forma di molecole RNA precursore.
Il precursore viene trasformato in rRNA maturo per escissione delle porzioni in eccesso
(processing)
Unità 1
Unità 2
Unità 3
Unità 4
Unità 5
A
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
DNA
18S
5,8S
28S
B
I
5
ETS
ITS1
ITS2
11
18S
5,8S
28S
=
2
18S
5,8S
28S
RNA 20S
RNA 32S
3
1
4
18S
5,8S
28S
IV
5
5,8S
V
28S
RNA 41S
Processamento diverso dallo splicing
Perchè:
· gli RNA maturi vengono generati da tagli endonucleolitici (endonucleasi), e seguiti se
necessario da una "rifinitura" con esonucleasi (3' -> 5' 0 5' -> 3')
· ma non si ha la concatenazione dei frammenti prodotti come nello splicing.

Nucleasi

enzimi capaci di tagliare catene polinucleotidiche rompendo i legami fosfodiesterici tra nt adiacenti.
SONO:
· Numerose
· molto eterogenee per grandezza, struttura, meccanismo d'azione
e per il substrato su cui agiscono.
esistono:
DNasi (deossiribonucleasi) specifiche per
DNA
RNasi (ribonucleasi) specifiche per RNA
Alcune Nucleasi in grado di tagliare DNA e RNA
Endonucleasi - tagliano in posizione interna
Esonucleasi - rimuovono i nucleotidi a partire dalle estremità
Formation of phosphodiester bond
0
O-P=0
O-P=0
0
O-
5CH2
CH2
0
3
2
3
OH OH
Condensation
reaction
OH
O-P=O Phosphodiester + H2O
bond
OH
another
chemical
bond
-O-
1
O-P=0
5CH2
O
5CH2
OH OH
3
2
OH OH

Esonucleasi & endonucleasi

Le esonucleasi effettuano
i tagli all'estremità della catena,
liberando singoli nucleotidi.
5'
-3'
ACGATCA
DNA a
filamento
doppio
TGCTAGT
.5'
3'
Le endonucleasi tagliano la
catena all'interno, producendo
delle interruzioni a filamento singolo.90
90
5'
3
V
e
RY
0
Base
CH
VII
5
Base
0=P-O-CH.
6

Endonucleasi

riconoscono e tagliano doppia elica (I)
· enzimi di restrizione (R.E.)
· nucleasi micrococcica (Staphylococcus)
· DNasi I (apoptosi) e II (funziona in modo ottimale a pH acido perché si trova comunemente nell'ambiente a
basso pH dei lisosomi)
· RNasi III (classe delle idrolasi, es. Dicer, rRNA)
riconoscono e tagliano singolo filamento (II) || 5'
3'
· tRNA 3' endonucleasi,
· RNasi P (richiesta per small non coding RNA, come geni tRNA, 5S rRNA, SRP RNA e U6 snRNA)
. nucleasi S1 (forse collegate alla morte programmata cellulare, in eucarioti e procarioti)
· "cleaving factor" CFI e CFII (coinvolte nel processo di taglio pre-mRNA)
7

Esonucleasi

Possono essere distinte in Eso 5'-3' e 3'-5'
5'-3' (III) - es il dominio 5'-3' exo della DNA polimerasi I di E. coli
3'-5' (IV) -> PNPasi di E. coli, esosoma del lievito, il dominio "correttore di bozze" delle DNA
polimerasi
3'
I
IV 5'
8

Esonucleasi processive e non processive

Divise anche in
processive
Esonucleasi attaccata all'estremità della molecola di acido nucleico, dopo rimozione primo nt,
prosegue nella rimozione del secondo, terzo nt ecc. (V);
- exonucleasi I di E. coli
3'
V
non processive
dopo rimozione nt all'estremità, si staccano dal polinucleotide substrato che viene
aggredito da eso che rimuove il secondo nt, per poi a sua volta distaccarsi ecc.
· esonucleasi III di E. coli
· l'esonucleasi T7.
VI
3'
9
La maggior parte delle endo- ed exo- tagliano a monte del
gruppo fosfato (P) lasciando questo gruppo al 5' del
nucleotide seguente (VII);
alcune, al contrario, tagliano a valle del gruppo fosfato
lasciando questo al 3' del nucleotide a monte (VIII)
es nello splicing degli introni contenuti nei tRNA
E
5'
3
=
3
IV 5'
3
VI
3'
5'
I
i
5'
Base
O=P-O-CH2
O
3'
O
C
VII
-
5'
Base
O=P-O-CH2
O
3'
VIII
O
O -- - -- 00
3'
10

Geni rRNA nei procarioti (E.Coli)

VPROCARIOTI: geni rRNA (esempio per E.Coli)
presente in 7 copie, organizzati in 7 operoni
Struttura di un operone (rrnD) contenente i geni rRNA
16S, 23S e 5S, e 3 geni tRNA
operone genera un precursore 30S processato da
Rnasi III (endonucleasi)
I tRNA saranno invece maturati con un
altro meccanismo
tRNA
16S
23S
5S
si forma regione a doppia elica per appaiamento regioni
complementari fiancheggianti seq 23S e funge da
substrato per il taglio RNasi III.
Stesso meccanismo per il 16S
ribonucleasi RNasi E è responsabile della rimozione del
G
RNasi III
Î
G
C
FG
RNasi III
5S dalla molecola di precursore.
rRNA
23S
A
G
11

Geni rRNA negli eucarioti

EUCARIOTI: geni rRNA
i geni che codificano il pre-rRNA sono ripetuti in tandem e localizzati su diversi
cromosomi
contengono centinaia di copie di ciascun gene.
Ogni gene del pre-rRNA è separato dal successivo da una regione spaziatrice non
trascritta (NTS).
12

Struttura geni rRNA mammiferi

Struttura geni rRNA es mammiferi.
In tandem in una o più localizzazioni nel genoma.
(A)unità ripetitiva costituita da:
· regione non trascritta NTS (Non Transcribed Spacer)
Unità 1
Unità 2
Unità 3
Unità 4
Unità 5
A
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
NTS
Gene rRNA
DNA
· regione trascritta comprende
18S
5,8S
28S
B
1
5'
ETS
ITS1
ITS2
1
18S
5,8S
28S
=
RNA 41S
2
18S
5,8S
28S
RNA 20S
RNA 32S
3
I
4
18S
5,8S
28S
IV
5
5,8S
V
28S
Trascrizione
(RNA Pol I)
✗
ETS (External Transcribed Sequence),
✗
gene 18S rRNA,
✗
ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1),
✗
gene 5,8S rRNA
✗
ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2),
✗
gene 28S. rRNA
(B)trascrizione produce un lungo precursore,
RNA 45S (I),
la maturazione include:
(1) Rimozione estremità 5' e formazione precursore 41S (II).
(2) 41S viene scisso in precursore 20S (18S) e 32S (rRNA 5,8S e 28S) (III).
(3) Rimossa estremità 3' del precursore 20S formando rRNA18S maturo, mentre
(4) Taglio precursore 32S libera gli rRNA maturi 5,8S e 28S (IV), che si associano
(5) per complementarietà delle basi (V).
13

Processamento dei tRNA (Maturazione)

3' RNA 45SNucleasi
(procarioti e eucarioti)
14

Maturazione dei tRNA

Maturazione dei tRNA
tRNA precursore
tRNA maturo
RNAsi P
tRNA esonucleasi
3'
CCA
3'
5
Braccio
Braccio
- c-
Braccio
dell'anticodone
Nucleotide
discriminante
senza CCA
ma aggiunta
3
3
C
C
5
5'
tRNA
nucleotidil-
transferasi
5
5
tRNA
splicing
-
0
e
Introne
Endonucleasi
di splicing
Endonucleasi
di splicing
Introni rimossi
maturazione tRNA eucarioti (monocistronici)
1. tRNA 3' endonucleasi effettua un taglio
immediatamente a valle del nt discriminante (D)
(importante per il riconoscimento specifico da parte
della amminoacil-tRNA sintetasi)
I
2. il taglio da parte dell'RNasi P genera l'estremità
5' del tRNA;
1
3. tRNA nucleotidil transferasi aggiunge la
tripletta CCA al 3';
4. se il precursore del tRNA contiene un introne,
questo viene rimosso da una specifica
endonucleasi.
..-.. ... -.. ... -.
I
I
1
1
1
15
----
RNasi P
tRNA 3'-endonucleasi
4000
D'
D
maturazione tRNA procarioti:
1. Una tRNA 3' endonucleasi effettua un taglio nella regione 3' del
precursore;
2. varie tRNA esonucleasi rimuovono i nt in eccesso fino al 3' del
tRNA maturo;
3. taglio effettuato dall'RNasiP genera l'estremità 5' del tRNA
maturo.
tRNA 3'
endonucleasi
400
5

Ribozimi autocatalitici a "testa di martello"

Ribozimi autocatalitici a "testa di martello"
(hammerhead) costituiti da RNA di 200-400 nt in grado di effettuare un taglio autocatalitico che
porta a formazione di un fosfato ciclico 2'-3' all'estremità 3' e di un ossidrile all'estremità 5
NH2
NH2
----
O
O= P-O"
N
-O
C
Prodotto 5'
O.
C
:B
P
O
O-H
O=P-O"
H
C
G
N
H
N
H2N
G
H -A
HO
N
H2N
O
O
Prodotto 3'
-
O=P-0"
0=P-0"
L'attività funzionale dei ribozimi hammerhead consiste nel processamento dei piccoli genomi a
RNA di alcuni viroidi patogeni delle piante.
Interessanti perchè utilizzati in tecniche di ingegneria genetica.
ribozimi artificiali costituiti da due distinte molecole di RNA, una contenente il sito di taglio
(substrato) e l'altra ccon attività enzimatica possono avere importanti applicazioni
biotecnologiche: silenziamenti genici mirati per combattere malattie virali come l'AIDS e l'epatite
B, e altre importanti patologie come il cancro, il diabete, l'artrite reumatoide e la sclerosi laterale
amiotrofica.
16
P
N
OLa maturazione dei tRNA viene
completata da una serie di modificazioni dei nucleotidi
operate da fattori enzimatici specifici
17

Ribonucleosidi modificati

ribonucleosidi modificati
base
HO
O
OH OH
intervengono numerosi enzimi che agiscono in vie metaboliche anche complesse
abbondanti nei tRNA e rRNA
→
- presenti in snRNA (RNA spliceosomiali), snoRNA (nucleolari) siRNA, miRNA e piRNA
(piccoli RNA regolatori)
descritte centinaia di modificazioni chimiche dei ribonucleosidi
18

Modificazioni chimiche delle basi e del ribosio

Modificazioni chimiche delle basi e del ribosio
il processo di maturazione dell'RNA necessita di numerosi enzimi che introducono modificazioni chimiche:
· delle basi azotate - a livello di atomi di C (es. posizione 5, C ) o di atomi N (es. posizione 7, G)
· dello Zucchero (ribosio), solitamente al gruppo ossidrile al 2'(es. formazione di 2'-idrossimetile).
· Nelle basi azotate, altre posizioni frequentemente modificate sono i gruppi amminici in posizione 6 -
Adenina e in posizione 2 Guanina, come pure nella posizione 3 Citosina.
CITOSINA
Grupo amino
H
H
1
N
I
H
4
C
N
3
5
6
G-
1
H
N
Grupo oxo
H
GUANINA
Grupo oxxo
O
H
/
N -
N
7
1
H-C&
2
9
C
- C
N
N
N-H
H
H
Grupo amino
ADENINA
Grupo amino
H
H
N
C
N-
6
7
/
1
H-C 8
1
9
C
C
3
N
N
H
/
H
5' CH2OH O
OH
4'
1'
3'
2'
OH
OH
Ribosio
19
G 5
N
2
4
o=CR
4
3
1
1
-0Modificazioni chimiche delle basi e del ribosio
la maggior parte si osserva nei tRNA
esempio (lievito) ...
si suppone triplice funzione delle modificazioni:
1. nell'ansa dell'anticodone regolano l'efficienza della traduzione e la crescita cellulare
2. nel corpo centrale del tRNA modulano la struttura secondaria e terziaria e la sua stabilità
3. alcune sono fondamentali per determinare l'identità e la specificità dei tRNA.
3'
C
tRNA Phe
C
A
5'
G
C
G
Braccio
accettore
G
A
Braccio TyC
Braccio D
CU
GACAC
mA
D
A
CUCG
m5CUGUG
C
G
GAGC
U
GGA
m7
m2,2G
A
G
G
C
-
G
Braccio
variabile
C
G
A
-
U
GmºC
A
- Cm
A
U
yW
Gm
A A.
G
m2A
G
D
C
Braccio
dell'anticodone
20