Nematelminti: vermi tondi, morfologia e cicli biologici in Biologia

Conservazione appropriata dei campioni

• Analizzate entro poche ore dal prelievo
• Conservare a temperature di refrigerazione (4 ℃) per qualche giorno
• Campione lasciato a temperatura ambiente per molto tempo non dovendo esporlo alla luce solare diretta (si mette all'ombra) e bisogna utilizzare un contenitore adiabatico (scatola polistirolo) perché altrimenti gli elementi parassitari potrebbero alterarsi o svilupparsi, con difficolta nella loro identificazione
• Congelamento: da evitare, perché può causare la distruzione degli elementi parassitari

Esame Macroscopico

• Valutazione delle caratteristiche fisiche del campione
• Visualizzare parassiti visibili ad occhio nudo come, ad esempio ascaridi adulti e proglottidi o frammenti di strobila di cestodi
• Valutati anche: consistenza, aspetto, colore e presenza di muco, sangue e/o materiale alimentare non digerito
• Ritrovamento di parassiti visibili macroscopicamente consente una diagnosi immediata ma non si può escludere che l'animale possa essere infestato anche da altri parassiti - associare esame microscopico

Striscio a Fresco

Tecnica rapida ed economica impiegata per la ricerca di cisti, oocisti, trofozoiti, uova e larve di parassiti Poiché per questo esame viene utilizzato un piccolo quantitativo di feci (ad esempio prelevato dall'ampolla del termometro dopo la misurazione della temperatura), la sensibilità diagnostica è molto bassa (10-20%) (Utilità per la ricerca di elementi parassitari che verrebbero alterati morfologicamente utilizzando le tecniche di flottazione, come ad esempio trofozoiti di Giardia spp)

Esecuzione dello striscio a fresco

Porre un piccolo quantitativo di feci su un vetrino coprioggetto. Miscelare le feci con una goccia di soluzione fisiologica o acqua fino ad ottenere un film sottile, omogeneo e trasparente. Coprire il vetrino portaoggetto con un vetrino coprioggetto. Osservare al microscopio.

Flottazione

tecnica utilizzata per concentrare e mettere in evidenza uova e oocisti, sfrutta il diverso peso specifico (p.s.) di elementi parassitari, detriti fecali e soluzioni. No ideale per le larve.

Principio della tecnica di flottazione

Le uova e le oocisti, quando immerse in una soluzione con p.s. superiore, tendono a galleggiare portandosi sulla superficie della soluzione (i detriti fecali, più pesanti, si posizionano sul fondo della provetta)

Esecuzione della flottazione

• Miscelare 3-5 g di feci con 10 ml di soluzione per flottazione (solitamente si usa una con peso specifico di 1200 ottenuta miscelando acqua e sale da cucina ottenendo un'acqua sovrasatura di sale ovvero il sale non si scioglie più ma si deposita sul fondo) soluzione flottante > soluzione a elevato peso specifico (1100-1200 fino a max di 1400) ottenuta miscelando acqua con sali o zuccheri
• Omogeneizzare uniformemente il composto utilizzando un mortaio e un pestello.
• Filtrare attraverso un doppio strato di garza o utilizzando un colino
• Riempiere una provetta da 12 o 15 ml con il campione filtrato
• Centrifugare a 650 g per 5 minuti (riduce i tempi necessari per la flottazione)
• Posizionare la provetta in un porta provette che la tenga perfettamente verticale- Riempire la sommità della provetta con la soluzione flottante fino a formare un menisco sulla sommità della provetta
• Porre un vetrino coprioggetto sul menisco Dopo aver lasciato il campione a flottare per 5-10 minuti, rimuovere il vetrino coprioggetto dalla provetta per porlo su un vetrino portaoggetto e osservare al microscopio

Flottazione Semplice

la procedura e identica senza il passaggio di centrifugazione. Il campione deve essere lasciato flottare per 20-30 minuti

Sistemi di flottazione commerciali

Sul mercato esistono diversi prodotti già pronti all'uso, di facile utilizzo e rapida esecuzione Limiti principali:

• Utilizzo di piccoli quantitativi di campione
• Impossibilità di centrifugare
• Sensibilità diagnostica ridotta rispetto alle tecniche di flottazione classica

Tecnica di Baermann

Si impiega soprattutto per la ricerca e l'identificazione delle larve di primo stadio (L1) della maggior parte dei nematodi cardio-polmonari L'apparecchio è costituito da un imbuto di vetro al quale viene adattato un tubo di gomma morbida chiuso all'estremità con una pinza Utilizzo: ricerca delle larve (L1) di nematodi (protostrongilidi, metastrongilidi, dictyocaulidi) Principio: sfrutta la mobilità, l'idrotropismo positivo (se immerse nell'acqua si spostano autonomamente dal campione fecale all'acqua) ed il peso specifico delle larve di nematodi polmonari (affondano) Di fondamentale importanza che i campioni fecali siano freschi (altrimenti le larve muoiono) o conservati a temperatura di refrigerazione (4 ℃) per massimo 2-3 giorni.

Vantaggi della tecnica di Baermann

• Esecuzione semplice
• Molto economica (se fatta in laboratorio)

Svantaggi della tecnica di Baermann

• Feci fresche
• Necessità di esaminare più campioni di feci (le larve vengono eliminate in maniera intermittente in ambiente, servono 3 giorni consecutivi)
• Tempi (campione immerso nell'acqua per 24h)
• Operatore esperto per la lettura

Esecuzione della tecnica di Baermann

• Porre 5-10 g di feci all'interno di un doppio strato di garza
• Avvolgere la garza per formare un sacchetto contenente le feci al suo interno
• Porre il campione all'interno dell'imbuto, si chiude con una pinza il tubicino e viene ricoperto il campione con acqua di fonte tiepida (circa 37 ℃) per favorire la migrazione delle larve dal materiale fecale all'acqua.
• Trascorse 24 ore si apre la pinza e si raccolgono 15 ml del liquido situato nella parte più declive dell'imbuto, utilizzando una provetta conica.
• Centrifugare a 600 g per 5 minuti o aspettare 30 minuti se non si centrifuga
• Eliminare il liquido capovolgendo delicatamente la provetta
• Pone il sedimento su un vetrino portaoggetto
• Aggiungere una goccia di soluzione di Lugol (uccide le larve e le colora) -non è necessario-
• Coprire con un vetrino coprioggetto
• Esaminare al microscopio

Copro-Antigeni

Test immunodiagnostici: Rilevano gli antigeni specifici di alcuni parassiti presenti nelle feci degli animali infestati, tramite anticorpi monoclonali in grado di legarsi ai copro-antigeni dei parassiti. Disponibili in commercio kit rapidi basati sulla tecnica ELISA e/o sull'immunomigrazione rapida a flusso laterale possono essere usati in ambulatorio

• Forniscono i risultati in poco tempo e senza particolari conoscenze tecniche
• Possono essere eseguiti su campioni congelati (Per cane e gatto reperibili sul mercato per alcuni nematodi intestinali, Cryptosporidium spp. e Giardia spp) Per tutti i kit esiste una finestra di controllo e una finestra di lettura. Finestra di controllo-> spot/linea che si colora ogni volta che si fa il test (indipendentemente se l'animale è positivo o negativo) Finestra di lettura > spot/linea si colora solo se l'animale è positivo Per esaminare le uova > flottazione Per esaminare le larve-> tecnica di baermann

Artropodi

Regno Animalia PHYLUM Artropoda

Artropodi Ectoparassiti

CLASSE INSECTA INSETTI CLASSE ARACNIDA ARACNIDI 3 paia di arti 4 paia di arti Copro diviso in segmenti (o SETTI) Non hanno il corpo suddiviso in setti Copro diviso in TESTA - TORACE - ADDOME Copro diviso in CEFALOTORACE E ADDOME

CLASSE INSECTA = INSETTI -> pulci, pidocchi, zanzare, flebotomi, mosche CLASSE ARACNIDA= ARACNIDI-> Zecche e Acari

Pulci

classe: Insecta Ordine: Siphonaptera Insetti atteri (privi di ali) parassiti dell'uomo, di molti mammiferi e uccelli, , dimensioni ridotte 1-6 mm, dotati di apparato buccale pungitore e succhiatore 3 specie principali, presenti in Italia, che possono infestare indifferentemente cane o gatto e, soprattutto in assenza degli animali, l'uomo:

• Ctenocephalides felis felis
• Ctenocephalides felis canis
• Pulex irritan

I cani e i gatti sono i principali ospiti di C. felis e C. canis, che possono infestare anche l'uomo e altri animali. Le pulci, a differenza dei pidocchi, non sono ospiti specifici. Ctenocephalides felis è la pulce più frequente anche nei cani. Pulex irritans solitamente infesta l'uomo, può parassitare gli animali sporadicamente, in contesti geograficamente isolati o legati a situazioni ambientali particolari. Le pulci dei cani e dei gatti possono alimentarsi sull'uomo quando l'infestazione ambientale è molto elevata o quando gli animali, per una qualunque ragione, hanno abbandonato il contesto abitativo. È difficile che le pulci abbandonino i loro ospiti preferenziali per pungere l'uomo o preferiscano parassitare gli esseri umani in presenza di cani e gatti

Morfologia delle pulci

• Corpo appiattito latero-lateralmente
• Esoscheletro compatto e robusto
• Capo è compresso contro il torace, poco mobile, mostra antenne tri-articolate molto brevi e apparato boccale pungente-succhiatore
• Setole, unghie > permettono alla pulce di muoversi più facilmente tra il pelo dell'animale
• Ultimo paio di arti atto al salto, ben sviluppati (3° paio)

Come differenziare le pulci Ctenocephalides da quelle Pulex? Le pulci del genere Ctenocephalides (cane e gatto) hanno queste strutture dette > ctenida (pettini)

Ciclo Biologico delle Pulci

4 stadi: uovo, larva, pupa e adulto La trasformazione da uovo a adulto richiede un tempo variabile da due settimane a otto mesi, in funzione delle condizioni climatiche, dalla disponibilità di cibo e dalla specie Le pulci adulte vivono sull'animale dove si nutrono e accoppiano producendo uova Le uova cadono dall'animale in ambiente esterno e in 1-2 giorni schiudono liberando le larve Le larve si nutrono con le feci dei parassiti adulti - che contengono sangue perchè l'hanno succhiato dal cane - cadute a terra e con detriti organici presenti nell'ambiente Le larve evolvono in pupe all'interno di un bozzolo setoso rivestito di detriti - metamorfosi da pupa ad adulto Le pulci adulte fuoriescono dal bozzolo in cerca di una potenziale fonte di cibo > 2 gg per trovare l'ospite - Le pulci adulte possono uscire subito dal bozzolo o attendere di percepire vibrazioni, pressione, calore o diossido di carbonio, tutti segnali che rivelano la potenziale presenza di una fonte di cibo La maggior parte delle pulci sopravvive all'inverno nella fase di larva o pupa Habitat preferiti: nelle abitazioni le larve possono trovarsi nelle crepe dei pavimenti, sotto i bordi dei tappeti, nei letti coperte e cucce di animali domestici all'aperto, la sabbia. Ambiente domestico: ideale per il ciclo biologico Ambiente esterno: Aridità, raggi solari, umidità scarsa - uccidono le uova e le larve In ambiente esterno, generalmente, le pulci non trovano condizioni ideali per il ciclo biologico, soprattutto nel caso di aree (ad esempio giardini o prati) esposte alla luce solare Luoghi più favorevoli sono quelli in cui il terreno e umido e posto all'ombra, come ad esempio cucce, aiuole, parti inferiori dei cespugli e ogni luogo di soggiorno esterno degli animali, purché riparato Ctenocephalides felis ovodepone soprattutto nelle prime ore della mattina, viene ritrovato nei luoghi di riposo dell'animale Le larve si approfondano nelle fibre dei tappeti, lenzuola, cuscini perché hanno geotassi positiva e fototassi negativa (scappano dalla luce e tendono a andare verso il basso) Ectoparassiti permanenti (adulti) Sottrazione di sangue Lesioni cutanee

Ruolo Patogeno Diretto delle Pulci

• Si nutrono di sangue
• Causano dermatiti allergiche Reazione allergica

Ruolo Patogeno Indiretto delle Pulci

• Trasmettono malattie (D. caninum) Trasmissione di agenti patogeni
• Anemia (soprattutto nei giovani animali)
• Allergie/Lesioni cutanee: prurito, alopecia, eritemi
• Dermatite allergica da pulci (DAP)-> lesioni sulle aree lombosacrali (cane) lesioni a livello di dorso, fianchi, lombi, collo (gatto anche se meno rispetto al cane) alopecia, eritema, papule, scaglie e croste fortemente pruriginosa, autotraumatismi

Diagnosi

La diagnosi si può ottenere facilmente tramite l'identificazione visiva diretta degli insetti, delle feci o delle punture presenti sulla cute dell'ospite oppure uso la tecnica dello spazzolamento (spazzolo mantello, faccio