Fluorescence Basics: concetti fondamentali e spettrometro di fluorescenza

Evoluzione degli stati eccitati

Lo stato eccitato a minor energia che si ottiene per assorbimento di luce è il singoletto S1. Gli altri stati eccitati di singoletto ad energia maggiore sono indicati con S2, S3, ...

Dagli stati S2,S3, .. Si ha un rapido decadimento allo stato S1 IC = Internal Conversion in tempi di circa 10-13s.

Lo stato S1 ha tempi di vita variabili ma tipicamente di nanosecondi. Dallo stato S1 si possono avere diversi processi:

1. Decadimento allo stato fondamentale SO, senza emissione di radiazione ("non radiativo"). L'energia in eccesso della molecola viene dissipata temicamente con le molecole vicine.
2. Il decadimento ad S0 con emissione di luce. Questo fenomeno viene detto Fluorescenza.
3. La conversione ad uno stato di tripletto T1 (Inter System Crossing). Lo stato T1 a sua volta può decadere non radiativamente ad S0 o con emissione di un fotone, processo detto: Fosforescenza. I tempi di vita di T1 sono molto lunghi (da microsecondi a secondi q minuti) a causa della transizione proibita

Rappresentazione schematica dei processi

Chimica Fisica Biologica A.A. 2008-2009 Rappresentazione schematica degli stati e dei processi coinvolti nei processi di assorbimento / emissione / decadimento

Diagramma di Jablonski

A = Assorbimento F = Fluorescenza P = Fosforescenza S = stato di singoletto T = stato di tripletto IC = conversione interna ISC = intersystem crossing

Fluorescenza e lunghezze d'onda

La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d'onda uguali o maggiori dell'assorbimento.Si può osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza

Resa quantica di fluorescenza

Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti nr. fotoni emessi è un numero compreso tra 0 e 1 nr. fotoni assorbiti

I principali fluoreferi biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN.

Fluorofori e resa quantica

FLUOROFORI MAX. nm RESA QUANTICA Triptofano 348 0.2 Tirosina 303 0.14 Fenilalanina 282 0.04 Adenina 321 0.0004 Citosina 313 0.00008 NADH 470 0,02 H2O, pH = 7

Sonde fluorescenti

Molte applicazioni della fluorescenza si basano sull'uso di "sonde (probes) fluorescenti" legate covalentemente o non covalentemente a molecole biologiche

Strutture di alcune sonde fluorescenti

Figure 5.5 Structures of some fluorescent probes.

Sonde fluorescenti tipiche

Table 5.2 Typicalffluorescent probes"

Fluorofori tipici

TYPICAL FLUOROPHORES

Proteina verde fluorescente (GFP)

GREEN-FLUORESCENT PROTEIN (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306

Spettri di fluorescenza di GFP

Fluorescence Spectra of Cycle 3 GFP and wtGFP Fluorescence Spectra of CFP Fluorescence Spectra of Emerald GFP Fluorescence spectra of BFP Fluorescence Spectra of YFP

Spettrometro di fluorescenza UV-VIS

Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro)

Partial Key to PTI C-61 Diagram 1 - Xe Arc Lamp (excitation source) 3 - Excitation Monochromator (selects ex wavelength) 8 - Sample Holder 11 - Emission Monochromators (selects fluorescence wavelength) 12 - Detector Photomultiplier Tubes

Applicazioni della fluorescenza

Applicazioni della fluorescenza: Molecole biologiche possono essere "etichettate" con gruppi fluorescenti (fluorofori) per reazione chimica. In questo modo è possibile la identificazione di proteine, acidi nucleici.

Rivelazione qualitativa e quantitativa ad alta sensibilità di molecole biologiche

Microscopia di fluorescenza di tessuti cellule o strutture subcellulari.

Immagine di fluorescenza al microscopio

Immagine di fluorescenza al microscopio di Cellule endoteliali I nuclei sono colorati con DAPI (blu) i microtubuli sono colorati con fluoresceina (verde) e i filamenti di actina con TRITC (rosso).