Biologia Molecolare: Lezione 2 su DNA ricombinante e vettori plasmidici

BIOLOGIA MOLECOLARE - Lezione 2 - Prof.ssa V. Poli

26/11/24 SBOBINATORE: Gallino Lorenzo REVISORE: Dipinto Francesca

LEZIONE 2 - BASI BIOLOGICHE, MOLECOLARI E DI GENETICA UMANA: MODULO DI BIOLOGIA MOLECOLARE

La professoressa incomincia la lezione correggendo le domande relative agli argomenti della prima lezione: (La professoressa ricorda che chiunque risponda correttamente alla domanda avrà un bonus di 0.1 all'esame)

PRIMA DOMANDA: spiegate cosa avete capito della mission della biologia molecolare, cos'è la biologia molecolare.

RISPOSTA DEL COLLEGA: la mission della biologia molecolare, come suggerito dal cristallografo William Atsbury, si basa non sulla tecnica ma bensì sull'approccio delle cosiddette scienze di base. Essa individua infatti, al di sotto delle manifestazioni su larga scala della biologia classica, il corrispondente piano molecolare analizzante la genesi e la funzione. In particolare, la biologia molecolare è il fil rouge che unisce lo studio genico ai processi metabolici molecolari che avvengono all'interno dell'organismo umano. A questo proposito, in ambito medico, la mission della biologia molecolare corrisponde all'analisi e alla cura di una determinata patologia, ricercandone la causa a monte, non soffermandosi soltanto sulla sintomatologia come avviene per la medicina tradizionale.

RISPOSTA DELLA PROFESSORESSA: la collega ha ripetuto la citazione di William Atsbury e poi però ha ripreso con il fatto che la biologia molecolare sia davvero il fil rouge che sottende tutta la ricerca in biomedicina moderna e che si pone l'obiettivo di capire come funziona il genoma e come dal genoma possiamo arrivare alle manifestazioni più visibili, più macroscopiche della funzionalità degli organelli, delle cellule e degli organismi. Ci permette di andare alla radice dei meccanismi molecolari che legano la fisiologia e quindi anche di come questi meccanismi molecolari sono coinvolti (la professoressa utilizza il termine inglese "disrupted", traducibile con "prevenire", "interrompere") nella patologia. È solo conoscendo come dovrebbero funzionare le cose che possiamo capire perché non funzionano più e questo ci permette di andare a cercare le cause molecolari delle malattie con la possibilità di intervenire proprio su queste cause molecolari.

Come vedremo nel corso delle lezioni, soprattutto verso la fine con la parte di applicazioni pratiche della biologia molecolare, vedremo come ormai siamo in grado di manipolare in modo molto preciso il genoma e ci sono già delle terapie, di tipo terapia genica, approvate non tanto per aggiungere un gene, come era la classica accezione della terapia genica, ma correggere a livello molecolare una mutazione.

SECONDA DOMANDA: Definizione del DNA ricombinante?

RISPOSTA DEL COLLEGA. IL DNA ricombinante è una molecola di DNA ottenuta unendo in provetta delle molecole di DNA a doppia elica che in natura non sono unite. Si dice ricombinante proprio perché combina una molecola di DNA, quella da amplificare, con un'altra che funge da vettore, ossia da trasportatore della prima, che verrà duplicato e permetterà così di amplificare la molecola di DNA che si vuole studiare.

RISPOSTA DELLA PROFESSORESSA: il DNA ricombinante è una molecola di DNA che unisce almeno due molecole di DNA che originariamente non erano unite: una è la molecola di DNA che vogliamo amplificare. Perché abbiamo bisogno di amplificarla, perché non ne basta una? Per poterla studiare abbiamo bisogno di molte copie per i limiti di sensibilità di tutti i metodi che vengono applicati. L'altra molecola, che viene detto vettore, fa proprio il ruolo di vettore; quindi, trasporta la molecola di DNA che vogliamo clonare all'interno di batteri (si usa un ceppo particolare di E.Coli, che è la specie batterica più abbondante nel nostro intestino e sono stati selezionati per essere non patogenici, almeno che non ci siano livelli troppo alti). Quindi il vettore può trasportare la molecola di DNA che vogliamo clonare all'interno di questi batteri dove questo vettore stesso è in grado di duplicarsi autonomamente rispetto al genoma batterico; quindi, non si integra nel genoma batterico ma si duplica autonomamente formando molte copie di se stesso in modo che quando il batterio si divide, queste copie vengano assortite tra le due cellule figlie. Fondamentalmente non abbiamo nessun limite, purché possiamo crescere una quantità sufficiente di batteri, possiamo produrre una quantità tendente all'infinito di DNA ricombinante.

TERZA DOMANDA: Caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici?

RISPOSTA DEL COLLEGA: I vettori plasmidici sono elementi necessari per la tecnica del DNA ricombinante, il quale viene generato a partire dal frammento di un gene, inizialmente isolato e poi introdotto in un replicone; quindi si avrà il DNA che si replica in un batterio del replicone, questa molecola, la quale viene prodotta in un sistema cellulare clonato, genererà dei cloni batterici, ognuno dei quali conterrà numerose molecole di DNA identiche tra loro. I vettori maggiormente usati sono i plasmidi, i quali sono molecole circolari già presenti in natura che però vengono usati in seguito a modificazioni, caratterizzati dalla presenza di sequenze essenziali nelle quali può essere inserito il DNA che volgiamo clonare. I plasmidi, infatti, sono presenti in quasi tutti I cicli batterici e sono usati per scambiare informazioni genetiche come la resistenza agli antibiotici. In questo caso si fanno procedere con la crescita solo I batteri aventi ricevuto il plasmide; per riconoscerli si usa per l'appunto un antibiotico, poiché si avrà la sopravvivenza dei soli batteri che avranno ricevuto il plasmide. Questo meccanismo è utile perché permette di ottenere delle colonie cellulari contenenti tante copie dello stesso plasmide ricombinante.

RISPOSTA DELLA PROFESSORESSA: Le caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici che sono usati nella tecnologia del DNA ricombinante per clonare il DNA sono la capacità di replicarsi autonomamente nei batteri, la presenza di un'origine di replicazione in E.coli, un marcatore di selezione che ci permette di isolare I batteri che abbiamo inglobato nel plasmide (quindi In genere sono geni per la resistenza agli antibiotici) e una regione che è stata manipolata dai biologi molecolari per poter integrate facilmente le molecole che vogliamo clonare.

CARATTERISTICHE ESSENZIALI DEI PLASMIDI

ORI Region into which DNA can be inserted Plasmid cloning vector amo

VETTORI USATI PER IL CLONAGGIO DEL DNA RICOMBINANTE: i PLASMIDI

• Molecole extra-cromosomali di DNA circolare capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale. Presenti in natura (batteri, lieviti, alcuni eucarioti superiori) in stato di relazione parassitica o simbiontica verso la cellula ospite.
• portatori di geni che arrecano un vantaggio selettivo alla cellula ospite (es. resistenza a un antibiotico)
• Possono ospitare DNA estraneo (con limiti di grandezza)
• Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale del batterio.

Un'altra caratteristica essenziale è ovviamente quella di essere in grado di purificare facilmente il DNA plasmidico dal DNA batterico: questo è facile con una serie di approcci tecnici perché si basa sulla differenza del peso molecolare di quello del plasmide, che è più piccolo di quello del cromosoma batterico di cui riusciamo a liberarci.

Abbiamo visto anche l'origine di replicazione, il marcatore di selezione, possibilità di formare colonie e anche una regione adatta a inserire il DNA che vogliamo clonare. Esistono plasmidi diversi con regioni differenti perché sono state manipulate per generare quello che si dice un sito multiplo di clonaggio o polylinker: un polylinker è una regione di DNA (circa 50-100 basi) che contiene numerosi siti di riconoscimento, quindi sequenze di DNA riconosciute da delle endonucleasi (enzimi) che sono capaci di tagliare il DNA (non di digerirlo da un'estremità ma di tagliarlo al centro) in corrispondenza di una particolare sequenza. Queste endonucleasi sono dette endonucleasi di restrizione o enzimi di restrizione.

Caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici:

1. ORI Origine di replicazione in E. Coli Region into which Plasmid cloning vector DNA can be inserted amp
2. Marcatore di selezione che permette ai batteri trasformati di crescere su terreno selettivo
3. Regione adatta ad inserire il DNA da clonare (sito multiplo di clonaggio o Multiple Cloning Site -MCS-, o poly-linker)

Questi enzimi ci consentono di tagliare il DNA in frammenti non casuali perché la lunghezza di questi frammenti dipende dalla sequenza riconosciuta dall'enzima. Ogni enzima di restrizione può generare delle estremità diverse, non nette, ma con alcuni nucleotidi che sporgono o da 3' o da 5'. Questa è una caratteristica essenziale perché ci permette di unire in modo specifico delle estremità di DNA generate dallo stesso enzima di restrizione. Sono un formidabile strumento per l'analisi e per la successiva manipolazione del DNA.

ENZIMI DI RESTRIZIONE

Sono enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze: si introduce per la prima volta il concetto di una proteina che riconosce una sequenza di DNA, concetto che si riprenderà per capire come funzionano I fattori di trascrizione che anche devono riconoscere delle sequenze specifiche sui promotori sugli enhancer. Esistono tipi diversi, in genere purificati da ceppi batterici diversi; ognuno di questi tipi riconosce sequenze specifiche.

• Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica.
• Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri.

(a) (b) Restriction enzyme EcoRI EcoRI methylase Unmethylated 5' 7 GAATTCO CTTAAG 3 3 Unmethylated 5' DNA GAATTCE CTTAAGD 5 Cleavage Restriction enzyme EcoR Sticky ends DAICH EcoRI will not cleave methylated DNA 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 Methylated DNA 5 GAATTC CTTAAG 5 CH3

Come sono stati scoperti? Sono stati scoperti da Hamilton Smith nel 1970 ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica: questo enzima, il primo ad essere isolato, si chiama EcoR1. Questi enzimi si chiamano di restrizione per la funzione che svolgono nei batteri, ovvero I batteri di E.Coli (Eco sta per E.Coli) producono questo enzima di restrizione che riconosce la sequenza GAATTC. Abbiamo la stessa sequenza da 5' a 3' sul filamento superiore e sul filamento inferiore: quindi l'enzima riconoscerà tutti e due I filamenti e taglierà dopo la prima G delle 6 basi che rappresentano il suo sito di riconoscimento. Quindi le due estremità che vengono liberate avranno 4 nucleotidi che sporgono in 5'.

Ma se EcoR1 produce un enzima di questo genere, è pensabile che non esistano sequenze GAATTC nel suo genoma? Abbastanza improbabile, infatti ne esistono un sacco. Il batterio, quindi, deve avere un modo di proteggere le proprie sequenze dall'azione di EcoR1: infatti il sistema di restrizione presenta una endonucleasi, ma anche una metilasi che metila l'adenina in terza posizione su tutti e due i filamenti e il sito di riconoscimento, quando metilato sull'adenina, non viene tagliato e quindi protetto dal taglio di EcoR1. Ne deriva quindi che qualsiasi DNA estraneo che non provenga da batteri dello stesso ceppo, non avrà la mutilazione sul sito di EcoR1, e quindi sarà tagliato e poi degradato dal batterio. Quindi è una forma rudimentale di protezione immunitaria e serve fondamentalmente a proteggere I batteri dai batteriofagi che derivano da altri ceppi batterici che andrebbero a distruggere il DNA e quindi impedisce di subire la lisi.

Gli enzimi di restrizione proteggono I batteri dall'introduzione da molecole di DNA esogeno e potenzialmente patogeno. Si pensi di avere dei batteriofagi che infettano un batterio del ceppo a, che vengono prodotti successivamente all'infezione di un batterio del ceppo a, porteranno alla lisi del batterio e come fanno tutti i virus, in seguito all'infezione di una cellula, dopo la produzione di tanti virus, lisi e morte cellulare della cellula, I virus batteriofagi prodotti andranno a cercare nuove cellule, e se trovano cellule del ceppo a, queste verranno lisate, ma se infettano invece un batterio di ceppo b, questo avrà un sistema di restrizione e modificazione che non era presente nel ceppo a: le sequenze riconosciute dalla sua endonucleasi di restrizione non saranno tagliate e quindi il batterio sopravviverà.

Quello che utilizziamo in biologia molecolare sono le endonucleasi di restrizione di tipo 2: 3 DNA 5