Genetica: duplicazione del DNA e replicazione negli eucarioti

La duplicazione del DNA

Grazie alla serie di esperimenti fondamentali citati precedentemente si è compresa la struttura e le caratteristiche del DNA. Ciò che risulta affascinante è che il DNA deve essere complessato all'interno della cellula perché ogni cellula contiene 46 cromosomi che corrispondono a circa 2 metri di DNA, 3 bilioni di basi, 40.000 geni codificanti per proteine all'interno del nostro genoma. Perciò come abbiamo detto questo DNA deve essere fortemente compattato per poter entrare all'interno del nucleo altrimenti le 3 bilioni di basi non riuscirebbero a stare in cellule visibili solo al microscopio. Ogni base può essere considerata come una lettera dell'alfabeto esattamente come le 26 lettere del nostro alfabeto costituiscono un testo nella stessa maniera le quattro lettere A T G C costituiscono il testo dell'informazione genetica.

Già Watson e Crick avevano capito che la struttura che loro proponevano, la molecola di DNA a doppia elica, ben si prestava ad una duplicazione ed immaginavano che la duplicazione del DNA potesse essere dipendente dallo srotolamento della doppia elica in maniera tale che ciascun filamento possa rappresentare lo stampo per la sintesi di una nuova elica. Questo tipo di replicazione oggi sappiamo chiamarsi semiconservativa, per cui ciascuna elica del DNA parentale funge da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare ad una delle due eliche, in maniera tale che dopo la prima replicazione si ottenga del DNA costituito da un'elica parentale e un'elica di nuova sintesi, e così via dopo la seconda duplicazione rimarrà sempre del DNA contenente un'elica parentale e un'elica di nuova sintesi, mentre quest'ultima farà da stampo essa stessa per una nuova molecola di DNA.

In realtà non si è arrivati a capire immediatamente che fosse questo il modello di replicazione del DNA poiché alcuni immaginavano un modello conservativo dove una doppia elica di DNA potesse fungere da stampo per una doppia elica di nuova sintesi, alcuni addirittura ipotizzavano un modello dispersivo nel quale il DNA parentale veniva frammentato con il DNA di nuova sintesi e si aveva una specie di rimescolamento delle sequenze.

• a) Modello semiconservativo
• b) Modello conservativo
• c) Modello dispersivo

Parentale Parentale Parentale Dopo il primo ciclo di replicazione Dopo il primo ciclo di replicazione Dopo il primo ciclo di replicazione 1 1 1 Dopo il secondo ciclo di replicazione Dopo il secondo ciclo di replicazione Dopo il secondo ciclo di replicazione Figura 3.1 Tre modelli per la replicazione del DNA. I filamenti parentali sono mostrati in rosso e quelli neosintetizzati sono mostrati in blu. 21Genetica - Professoressa Paola Pontrelli a.a. 2020/2021 - Università Aldo Moro di Bari

L'esperimento di Meselson e Stahl

Nel 1958, Matthew Meselson e Frank Stahl ottennero la prova sperimentale che il modello di replicazione semiconservativo era quello corretto.

Condussero degli esperimenti sulle cellule procariotiche che venivano fatte crescere all'interno di un terreno contenente l'isotopo 15 dell'azoto (anche detto azoto pesante perché contiene un neutrone in più all'interno del nucleo) in cui era possibile vedere fisicamente il DNA facendo una centrifugazione su un gradiente di cloruro di cesio. Centrifugando su un gradiente di cloruro di cesio, il DNA si andrà a posizionare in una regione del gradiente che corrisponde alla sua densità e quindi al suo peso. Centrifugando il DNA delle cellule cresciute in questo mezzo ottenevano una banda in corrispondenza di una determinata regione del gradiente. Le cellule procariotiche cresciute in questo mezzo vennero poi trasferite in un terreno di coltura contenente azoto leggero, quindi l'isotopo 14 che differisce dal precedente per un neutrone in meno nel nucleo. Questo chiaramente va a modificare anche il peso molecolare della macromolecola nella quale viene inclusa l'azoto. E così andando a centrifugare, dopo un breve intervallo di tempo, l'estratto ottenuto da queste cellule procariotiche osservarono che il peso molecolare del DNA era diverso rispetto al peso molecolare rilevato in prima istanza e questo peso molecolare era compatibile con un DNA ibrido costituito da un'elica parentale ed un'elica di nuova sintesi contenente rispettivamente una l'isotopo pesante e l'altra l'isotopo leggero dell'azoto. Continuando a raccogliere campioni a distanza di tempo, quindi dopo due generazioni, ritrovarono due bande proprio perché continuava a permanere una parte di DNA costituita dall'elica parentale e dall'elica di nuova sintesi e poi, come abbiamo visto prima, tutto DNA di nuova sintesi.

Esperimento di Meselson-Stahl (1958)

Si allestiscono colture batteriche in un terreno contenente 15 N (azoto pesante). Si trasferiscono alcuni batteri in un terreno contenente 1N (leggero): la crescita batterica continua Campione a 0 minuti Campione dopo 20 minuti Campione dopo 40 minuti Si raccolgono campioni dopo 0 minuti, 20 minuti (dopo un ciclo di replicazione) e 40 minuti (dopo due cidi di replicazione) ON/1ON DNAA (leggero) 10 NADN DNA (intermedio) ®NON DNA (pesante) Parentale (tutto pesante) Prima generazione {tutto intermedio) Seconda generazione (metà intermedio, metà leggero) 22 Prima che i batteri si riproducano per la prima volta nel substrato leggero {a 0 minuti), tutto il DNA (parentale) è pesante. Dopo due generazioni, metà del DNA è intermedio e metà leggero; non è più presente DNA pesante. Nuovo Filamento parentale EN filamento ONGenetica - Professoressa Paola Pontrelli a.a. 2020/2021 - Università Aldo Moro di Bari

La replicazione del DNA

La replicazione del DNA avviene in corrispondenza di particolari regioni dette origini di replicazione (sequenze ori). Nel caso delle cellule procariotiche esiste una sola origine di replicazione, nel caso invece degli eucarioti esistono più origini di replicazione.

Nel caso delle cellule procariotiche il cromosoma è circolare; in corrispondenza dell'origine di replicazione inizia lo svolgimento della doppia elica e si inizia a formare il complesso di replicazione. L'origine di replicazione è una regione del DNA caratterizzata da sequenze ripetute e sequenze ricche di A-T (interagiscono tra di loro e sono stabilizzate da due legami a idrogeno contro i 3 legami che stabilizzano l'interazione tra G-C perciò queste regioni nell'origine di replicazione sono delle regioni particolarmente ricche di A e T che dunque permettono lo svolgimento della doppia elica e l'ingresso di alcune proteine che promuovono la formazione di una bolla di replicazione). Si forma una vera e propria bolla che è costituita da due forcelle replicative, regioni in corrispondenza delle quali avviene lo svolgimento della doppia elica perché possa essere promossa la duplicazione.

Nel caso dei procarioti esiste un'unica origine di replicazione e normalmente il DNA delle cellule procariotiche è legato alla membrana plasmatica, quindi, alla fine della replicazione le due molecole di DNA saranno entrambe legate alla membrana. A questo punto attraverso un allungamento della membrana plasmatica i due cromosomi procariotici si separano tra di loro, si ha la formazione di un setto e così si divide il DNA .

Cromosomi procariotici

A 1 La sequenza ori lega il complesso che avvia la replicazione. Cluster di 3 coppie di ripetizioni di 13 bp (ricche di AT) e 4 coppie di seq di 9 bp che legano la prot. Iniziatrice DnaA 2 Due forcelle di replicazione avanzano in direzioni opposte, allontanandosi l'una dall'altra. ori ori Complesso di pre-replicazione or ori T

Nel caso invece dei cromosomi eucariotici sono presenti più origini di replicazione intersperse ogni 10.000-40.000 paia di basi, a partire da ciascuna di esse si formano delle forcelle di replicazione che si muoveranno in direzione opposta lungo il cromosoma lineare delle cellule eucariotiche finchè non si andranno a fondere. Non è detto che tutte le forcelle replicative si formino nello stesso momento, tuttavia quando si avvia la duplicazione in corrispondenza di una regione, a distanza di poco tempo, si avvia la duplicazione anche a partire da altre origini di replicazione ottenendo così i repliconi, che si uniscono per dare origine alla molecola di DNA duplicata. Ogni forcella continuerà ad andare avanti nella replicazione finché non incontra l'altra forcella.

Cromosomi eucariotici

B ori ori ori Contengono origini di replicazione multiple. Inizio della replicazione 000000 Tra 10000 e 40000 bp Le forcelle si muovono in direzioni opposte. of 00000 00000 100 2000000 0000000 0000 23Genetica - Professoressa Paola Pontrelli a.a. 2020/2021 - Università Aldo Moro di Bari

Gli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA

La replicazione del DNA avviene grazie a degli enzimi, le DNA polimerasi, e ne esistono diversi tipi di DNA polimerasi sia nei procarioti che negli eucarioti.

Una caratteristica comune sia alle cellule eucariotiche che alle cellule procariotiche è che le DNA polimerasi sono sempre capaci di aggiungere un nucleotide ad un'estremità 3' già esistente; non possono quindi iniziare un processo replicativo se non trovano un estremità 3' a cui aggiungere i nuovi nucleotidi. Questo vuol dire che la sintesi del nuovo filamento deve avvenire in direzione 5'-3'. Il nucleotide trifosfato, grazie all'idrolisi del legame che unisce due gruppi fosfato, ottiene l'energia sufficiente per poter formare il legame fosfodiesterico, un legame covalente forte, che permette la stabilizzazione della catena nascente.

In corrispondenza dell'origine di replicazione abbiamo la presenza di diversi enzimi, non è soltanto la DNA polimerasi che permette la duplicazione del DNA.

Il primo enzima che interviene è la DNA elicasi: enzima che, attraverso l'idrolisi di ATP, promuove lo svolgimento della doppia elica di DNA parentale in modo tale che possano entrare la DNA polimerasi ed altre proteine. Attacco delle elicasi alla doppia elica Forcella di replicazione 5P +3'OH Leading chain Leading 3'OH chain -5'P ATP ADP + PA ADP + P ATP Forcella di replicazione 1 molecola di ATP/giro d'elica DOC Le prime proteine che entrano nella forcella Attacco delle proteine ai filamenti singoli per mantenerli separati di replicazione che si sta formando sono le SSB Elicasi, proteine che si attaccano alla doppia elica e la aprono (single strand binding), legano il singolo . Proteine di srotolamento, che destabilizzano l'elica dopo essersi attaccate ai filamenti singoli filamento di DNA, sono importanti perché -Direzione di avanzamento stabilizzano il DNA a singola elica e permettono quindi al DNA di non arrotolarsi di nuovo su se stesso. Infatti la doppia elica nel momento in cui viene a formarsi la forcina viene sottoposto a una forte tensione a causa della super spiralizzazione del DNA in corrispondenza della forcella replicativa.

Affinché la forcella possa proseguire intervengono due enzimi che sono le topoisomerasi di tipo 1 e di tipo 2. Le topoisomerasi di tipo 1 sono degli enzimi che operano un taglio in corrispondenza di una sola elica del DNA a doppia elica: tagliando un filamento, le due eliche possono srotolarsi una sull'altra e impedire che si crei una super spiralizzazione a valle della forcella replicativa. Le Topoisomerasi di tipo 2 operano due tagli su entrambe le due eliche del DNA e permettono di srotolare la doppia elica e poi ricongiungere il DNA in modo tale da ricreare la molecola di DNA lineare.

Si tratta di enzimi ATPasici in quanto richiedono l'idrolisi dell'ATP per poter promuovere tutte queste operazioni di taglio e di ripristino della sequenza nucleotidica, ovvero attività che richiedono un apporto esterno di energia. Può agire o una o l'altra ma non insieme.