Dalle biotecnologie tradizionali alle biotecnologie moderne e ingegneria genetica

Biotecnologie: Storia e Tipologie

DALLE BIOTECNOLOGIE TRADIZIONALI ALLE BIOTECNOLOGIE MODERNE Pag. B123 - B135

La storia delle biotecnologie

Biotecnologia > si intende l'utilizzo di organismi viventi o parti di essi per la realizzazione di processi e prodotti utili alla società

Ci sono due tipologie di biotecnologie: Tradizionali: utilizzo di organismi viventi selezionati dall'uomo in base al fenotipo tra quelli disponibili in natura Moderne: utilizzo di parti di organismi viventi (molecole, cellule, tessuti) isolate con apposite tecnologie o sulla produzione di organismi geneticamente modificati e poi selezionati sulla base del genotipo.

Le biotecnologie tradizionali hanno avuto inizio più di 10.000 anni fa con la selezione delle varietà coltivabili e la domesticazione degli animali, questo dimostra che già in epoca antica gli agricoltori operassero un miglioramento genetico delle specie coltivate.

Oltre a modificare le piante, gli esseri umani impararono ad usare gli organismi per produrre alimenti ad alto contenuto energetico, con il processo della fermentazione si produceva birra ed ancora prima il vino, questo processo che utilizza microrganismi rappresenta il primo esempio di biotecnologie industriali

L'avvento delle biotecnologie moderne

Se incrociamo due individui, un certo allele si manifesta in una percentuale di discendenti che dipende dalla caratteristiche di dominanza o recessività

Ad ogni generazione, però, le piante figlie non riassorbono solo gli alleli desiderati, ma rimescolano il loro intero genoma in maniera casuale e questo rende ancora più lungo il processo di selezione, da alcuni decenni si trattano le specie vegetali da incrociare con agenti che inducono mutazioni.

Con l'ingegneria genetica è stato possibile inserire direttamente negli organismi, geni provenienti da specie evolutive molto distanti, generando varietà impossibili da ottenere con metodi tradizionali.

Gli organismi il cui genoma è stato modificato con l'ingegneria genetica sono detti organismi geneticamente modificati (OGM) , possono essere: Trasgenici se incorporano geni provenienti da specie diverse Cisgenici se i geni provengono dalla stessa specie

Tecniche di Ingegneria Genetica

Le tecniche dell'ingegneria genetica

Con l'ingegneria genetica (detta anche tecnologia del DNA ricombinante) è possibile alterare i fenotipi di un organismo attraverso la modificazione diretta dei genotipi agendo direttamente sul DNA.

Un DNA ricombinante è una molecola di DNA ove è presente informazione genetica proveniente da due o più organismi viventi.

Un passo fondamente è stato la scoperta di enzimi batterici in grado di tagliare ed incollare il DNA in specifiche posizioni:

• Le endonucleosi di restrizione
• Le DNA ligasi

Tagliare il DNA: gli enzimi di restrizione

Il DNA è un polimero formato da nucleotidi legati da un legame fosfodiesterico tra un atomo di fosforo ed uno di ossigeno, per rompere il legame occorre agire su questi legami usando > Enzimi di restrizione, che sono capaci di idrolizzare il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in corrispondenza di sequenze specifiche chiamate siti di restrizione; sono stati scoperti nei batteri e presentano due caratteristiche fondamentali:

• Tagliano entrambe le eliche del DNA
• Effettuano il taglio in corrispondenza di specifiche sequenze bersaglio, che nella maggior parte dei casi sono palindrome, ad esempio: 5' - AGTACT - 3' 3' - TCATGA - 5'

Enzimi di restrizione: EcoRI ed EcoRV

Uno degli enzimi di restrizione più usati è EcoRI (si legge eco-erre-uno), che deriva dal batterio Escerichia coli, EcoRI si lega alla sequenza palindrona:

5' - GAATTC - 3' 3' - CTTAAG - 5'

Il taglio avviene tra la prima G e l'estremità 5' e così la doppia elica viene spezzata in due frammenti:

5' - G - 3' 5' - AATTC - 3' 3' - CTTAA - 5' 3' - G - 5'

Dopo il taglio, le estremità dei due filamenti sono complementari ed il taglio ha generato delle estremità sfalsate, dette coesive (stiky ends)

Altri enzimi effettuano un taglio nel mezzo delle sequenza di riconoscimenti, per esempio EcoRV (eco-erre- cinque) riconosce la sequenza:

5' - GATATC - 3' 3' - CTATAG - 5'

Che introduce il taglio tra la A e la T centrali, generando estremità piatte (blunt ends):

5' - GAT - 3' 5' - ATC - 3' 3' - CTA - 5' 3' - TAG - 5'

A seconda delle necessità si può vare una o l'altra tipologia di estremità.

Le sequenze di riconoscimento non si presentano ad intervalli regolari ed i frammenti di restrizione hanno lunghezze diverse.

L'elettroforesi su gel

Dopo aver digerito una molecola di DNA con l'enzima di restrizione, bisogna verificare che la reazione enzimatica si sia verificata , è anche necessario separare il frammento della lunghezza giusta contenente il pezzo di DNA che si vuole isolare e questo è possibile tramite la visualizzazione diretta del DNA tramite elettroforesi su gel.

Nel gel è possibile separare i frammenti di DNA in base alla lunghezza.

L'elettroforesi permette di separare molecole cariche mediante un campo elettrico e per il DNA si usano due polimeri:

• L'agarosio, è un polisaccaride naturale estratto dalle alghe (liquido a 90° e solido a temperature inferiori ai 40°) ed è formato da molecole di galattosio, quando è solido i polimeri di galattosio si intrecciano a formare una rete dalle cui maglie il DNA può migrare e attraverso coloranti specifici si vedono i frammenti di DNA divisi tra più piccoli e grandi
• La policrilammide è un polimero artificiale che una volta formato il gel non torna più allo stato liquido (come invece fa l'agarosio) , ha una porosità inferiore all'agarosio e permette la separazione di frammenti più piccoli.

I campioni di DNA sono miscelati con un indicatore colorato che serve a visualizzare lo spostamento nel gel.

Una volta effettuata la separazione dei frammenti di DNA è possibile visualizzarli sul gel Nell'agarosio si usa il bromuro di etidio che si eccita nell'ultravioletto e quindi illuminando il gel con UV i frammenti di DNA brilleranno di un intenso colore rosso-arancio.

Ricucire il DNA: le DNA ligasi

Una volta ottenuto il frammento di DNA tramite un enzima di restrizione va «unito» alla molecola ricevente in modo da creare il DNA ricombinante.

Gli enzimi DNA ligasi ricostruiscono il legame fosfodiesterico utilizzando ATP come cofattore.

Tutte le cellule viventi possiedono DNA ligasi che sono gli enzimi essenziali per le reazioni di replicazione e riparazione del DNA.

Se immaginiamo di ricavare da organismi diversi due frammenti di DNA ottenuti con il taglio EcoRI, se li mescoliamo i due frammenti si uniscono spontaneamente grazie alla presenza di estremità coesive, ma sarà un'unione debole, ma si aggiunge DNA ligasi i due frammenti saranno uniti da un legame covalente (grazie al legame fosfodiesterico).

I vettori plasmidici

L'obiettivo di tagliare e cucire frammenti di DNA è quello di trasferire uno o più geni da un donatore a un ricevente.

Un volta ritagliato il gene lo inseriamo in un sistema di trasporto o «vettore» che lo veicoli all'interno di una cellula ricevente, ed i plasmidici batterici opportunamente modificati, si prestano a questo scopo.

I vettori plasmidici sono molecole di DNA che si usano per spostare i geni da un organismo ad un altro e quelli usati in laboratorio contengono:

• Un'origine di replicazione, per consentire una replicazione ogni volta che si verifica una divisione cellulare
• Uno o più geni per la resistenza agli antibiotici (geni reporter) che selezionano le cellule contenenti il vettore
• Un certo numero di sequenze uniche di riconoscimento per diversi enzimi si restrizione; sono poste in una regione chiamata sito multiplo di clonaggio, dove verrà inserito il frammento di DNA esogeno

Il clonaggio: molte copie dello stesso gene

Isolato il gene, l'obiettivo del biotecnologo è ricavarne un gran numero di copie identiche, si può fare in due modi:

• Per duplicare cellule intere ed il DNA che contengono si usa una biotecnologia chiamata clonaggio
• Per duplicare una sola sequenza nucleotidica si usa la reazione a catena della polimerasi (PCR)

Per clonare un gene i passaggi sono cinque:

1. Digerire il DNA donatore
2. Digerire il DNA ricevente con gli stessi enzimi di restrizione
3. Saldare il frammento di DNA
4. Inserire il vettore ricombinante all'interno della cellula ricevente
5. Selezionare le cellule riceventi contenenti il plasmide

I passaggi 1-3 corrispondono alla digestione degli enzimi di restrizione ed alla saldatura del DNA, poi segue l'inserimento del vettore plasmidico che contiene il gene di interesse della cellula ricevente (4) e poiché i vettori plasmidici contengono un gene reporter, viene sfruttato per selezionare le cellule effettivamente trasformate (5).

Ponendo le cellule trasformate in presenza dell'antibiotico specifico per il vettore utilizzato, solo quelle che hanno incorporato il vettore possono sopravvivere.

Si ottiene così una coltura pura di cellule contenenti il DNA esogeno.

Clonaggio: copie dello stesso gene - continua

Clonaggio non è sinonimo di «clonazione» , clonare il DNA significa ottenere molte copie identiche di uno stesso frammento, mentre la clonazione è la produzione di organismi geneticamente identici.

Il DNA da clonare viene inserito in un gene marcatore che consente di distinguere le colonie batteriche con l'inserto di DNA al loro interno, perché in alcuni casi il plasmide tende a richiudersi su se stesso senza includere il frammento di DNA.

La reazione a catena della polimerasi (PCR)

E' una tecnica rapida che permette di ampliare in provetta una specifica sequenza di DNA.

L'idea di base della PCR è semplice: partendo da una singola copia di una sequenza di DNA e facendola reagire con una DNA polimerasi, dopo una polimerizzazione si otterranno due copie, se la reazione è ripetuta per n cicli le copie saranno «2 alla n», questo processo è detto amplificazione del DNA.

Perché avvenga occorrono:

• Il DNA stampo (può essere un frammento, una miscela di c DNA o addirittura un intero genoma)
• Una coppia di frammenti di DNA sintetico a singola elica detti primer che forniscono l'innesco per la reazione di polimerizzazione
• Una DNA polimerasi termoresistente (Taq polimerasi) isolata dal batterio Thermus aquaticus
• Una miscela contenente i quattro nucleotidi trifosfato e i cofattori necessari alla DNA polimerasi 8