Marcatura di anticorpi: tecniche e applicazioni della fluorescenza

Marcatura di Anticorpi

Se il complesso Ag-Ab non è visibile è necessario renderlo rivelabile I Marcatura di anticorpo (a volte antigene) con un marcatore che possa essere rivelato qualitativamente e anche quantitativamente

Tecniche di Marcatura degli Anticorpi

• Radioisotopo (125I, 3H, 32P etc)
• Enzima (colorimetria, fluorimetria, enhanced chemiluminescence)
• Fluorocromo (Direct, time-resolved)
• Luminescenza (bioluminescenza, fosforescenza)

Microparticelle

• Streptavidina/avidina-biotina

Gli anticorpi marcati si dicono coniugati

Intervalli di Concentrazione degli Analiti del Siero Umano

QUANTITÀ (g/ml) HSA lgG IgM g-103 = mg CBG TBG g-10+ = ug MYOGL. OFP HPRL HGH GLUC. HTSH 2-10* = ng INSUL GASTR. ACTH ANGIO-11 PGF 20 ADH g-10-1 = pg I Intervalli di concentrazione di alcuni analiti del siero umano normale Necessità di grande sensibilità analitica: saggi immunochimici Amplificazione del segnale

Sensibilità delle Tecniche di Misura in Chimica-Clinica

Livelli di sensibilità di alcune tecniche di misura comunemente impiegate in chimica-clinica QUANTITA (g/ml) COLORIMETRIA 10-3 mg 10 ** 10-+ 10-12 PB SPETTROFOTOMETRIA TURBIDIMETRIA FLUORIMETRIA-NEFELOMETRIA CROMATOGRAFIA GL IMMUNOCHIMICA ANALITICA

Metodologie Immunologiche: Tracciante e Segnale

Tracciante: limite di rivelazione Deve essere presente nel tubo da saggio ad una massa estremamente bassa (10-12 - 10-20 g) e facilmente rivelabile. TRACCIANTE SEGNALE MASSA (moli/tubo) 125| ~ 10.000 dpm 0.1 - 10× 10-15 Enzima - Assorbanza 10-15 - 10-16 - Luminescenza 10-16 - 10-18 - Fluorescenza 10-15 - 10-18 - Amplificazione ciclica enzim. 10-20 - 10-21 Molecola fluorescente I fluorescente 10-18 - 10-19 Molecola chemiluminescente mV 10-16 - 10-18

Procedure Dirette e Indirette nella Marcatura

Procedure dirette: si marca l'Ag o l'Ab (primario) Procedure indirette: Ag-Ab rivelato da Ab secondario Molecola di antigene Anticorpi specifici per Ag, marcati con radioisotopi, fluorocromi o enzimi Ag -* * + 1 Ag Ag * * Tecnica diretta * * T * * Ag * 1 * Tecnica indiretta * K * più sensibili » * T * Anti-IgG marcata con radioisotopi, fluorocromi o enzimi (per esempio, anti-lgG di coniglio) » no rischio di perdita immunoreativit à per marcatura Figura 4.14 Rappresentazione schematica di metodologie immunochimiche dirette e indirette. Ag, antigene. Anticorpo specifico per Ag (per esempio prodotto in coniglio) +

Marcatura Radioattiva con Iodio 125

Marcatura radioattiva 0 Radioisotopo più usato è 125] (alta attività specifica, emissione Y, facile rilevazione e quantificazione): radioiodinazione Attenzione ad agente ossidante usato, può distruggere la reattività degli Ab Sandwich Format lodine 125 Solid Phase Competitive Format lodine 125

Marcatura con Enzimi

Usati in dosaggi immunologici (es .: ELISA), e anche in immunoblotting, immunoistochimica e citochimica. ] La rivelazione avviene seguendo una reazione enzimatica, in cui un substrato viene convertito in un prodotto rilevabile (es .: colorato) 0 Dosaggi immunoenzimatici: il prodotto deve essere solubile (quantificazione spettrofotometrica) Immunoblotting e immunoistochimica: il prodotto deve essere insolubile per consentire la precisa localizzazione L'uso di enzimi consente l'amplificazione catalitica del segnale (una molecola di enzima può convertire molte molecole di substrato)

Reagenti per Legami Crociati nella Marcatura Enzimatica

Reagenti che formano legami crociati (a) La glutaraldeide è un reagente omobifunzionale che instaura legami crociati tra i gruppi aminici H H 0 = C - (CH2)3 - C=O + Ab - NH2 + Enz - NH2 H - H 1 Ab - N = C - (CH2)3 - C = N - Enz 2H2O (b) SMCC è un reagente eterobifunzionale che instaura legami crociati tra gruppi aminici e gruppi sulfidrici O O Ab - NH2 + N - O - C- SMCC O O O 11 Ab - NH - C CH2 - N Ab - NH - C- 07 CH2 - N O O S-Enz Figura 4.17 (a) e (b) Struttura e modalità d'azione dei reagenti che formano legami crociati. Ab, anticorpo; Enz, enzima. + O CH2 - N O HS-Enz O

Principali Enzimi Utilizzati per la Marcatura

Principali enzimi utilizzati Enzima Sistema di rivelazione Metodologia analitica Perossidasi (EC 1.11.1.7) H2O2 / cromogeno H2O2 / luminolo Fotometria Luminescenza Fotometria Fosfatasi alcalina (EC 3.1.3.1.) B-Galattosidasi 4-nitrofenolo 4-metilumbelliferone 2-nitrofenolo Fluorimetria Fotometria (EC 3.2.1.23) 4-metilumbelliferone Fluorimetria Glucoamilasi Glucosio/NADPH Fluorimetria (EC 3.2.1.3) Catalasi (EC 1.11.1.6) Penicillari (EC 3.5.2.6) H2O2 / Entalpia (H) Fenossietilpenicillina /bromo-cresolo Calorimetria Fotometria

Vantaggi e Svantaggi della Marcatura Enzimatica

Vantaggi a. Versatilità nel metodo di lettura finale - visivo - colorimetria - fluorimetria - luminometria b. Fattibilità di sviluppo di test «a domicilio» c. Possibilità di sviluppo di dosaggi senza separazione Svantaggi a. La preparazione e la caratterizzazione di apteni e proteine coniugati ad enzimi presenta- no delle difficoltà - b. Alcuni enzimi (es. HRP) possono essere facilmente inattivati dall'azide o dalle superfici di polistirene c. Gli strumenti in commercio hanno intervalli di lettura limitati

Procedure Semidirette: Biotinilazione e Avidina/Streptavidina

Procedure semidirette Ab biotinilato + avidina/streptavidina NH NH 0 II C Avidina (CH2)4-C-NH-(CH2)6-NH-C-NH- S Braccio spaziatore spaziatore riduce Anticorpo biotinilato impedimento sterico Figura 4.18 Interazione tra una IgG coniugata a biotina e l'avidina. Il legame è molto forte e ogni molecola di avidina ha quattro siti di legame per la biotina. Nella struttura qui presentata, l'accoppiamento tra biotina e immunoglobulina avviene grazie all'estere N-idrossisuccinimmide biotinamidocaproico. Avidina/streptavidina vengono coniugate con fluorocromi o enzimi o radioisotopi

Marcatura mediante Fluorescenza

La FLUORESCENZA è l'emissione di radiazioni da parte di una molecola che da uno stato eccitato torna al suo stato basale La lunghezza d'onda assorbita deve avere valori minori (energia più elevata) rispetto a quella emessa (fluorescenza) La differenza tra queste due À è nota come spostamento (shift) di Stoke: migliori risultati per ampi shift di Stoke Si possono misurare: ❖ Spettri di eccitazione ed emissione ❖ Intensità di fluorescenza ❖ Tempo di emivita ❖ Polarizzazione Maggiore sensibilità rispetto ai metodi spettrofotometrici Grande selettività spettrale Necessario allestire curva di calibrazione

Efficienza Quantica e Relazione con la Concentrazione

Gli spettri di fluorescenza danno informazioni su eventi che avvengono in meno di 10-8 sec I Efficienza Quantica: Q = Quanti di fluorescenza emessi Quanti assorbiti Relazione tra Intensità di fluorescenza (I) e concentrazione dell'analita fluorescente (c) I = 2.3 I & cdQ I, è direttamente proporzionale a c Dove: d = percorso ottico (cm) £ = coeff. di estinzione molare (1/mol cm) I = intensità radiazione incidente

Fluorocromi Comuni

Fluorocromi 0 0 OH (CH, IN 0 NÍCH,), COOH FLUORESCEINA (verde) TETRAMETILRODAMINA (rosso) H.C c-0 N 1 0 HỘ HC 0 Eu* EUROPIO (111) N c-0 H.C 3 UMBELLIFERONE COOH

Fattori che Influenzano la Fluorescenza: Quenching

Attenzione! I Dipende da pH, temperatura, polarità del solvente I QUENCHING (Smorzamento): l'energia che dovrebbe essere emessa come fluorescenza viene trasferita ad altre molecole per interazione collisionale 0 Meglio a basse concentrazioni! 100 90 80 Apparent Fluorescence 70 smorzamento (quenching) 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 [Methylumbelliferone] AM

Caratteristiche dei Saggi Immunologici Basati sulla Fluorescenza

Caratteristiche dei saggi immunologici basati sull'impiego di fluorescenza Tracciante: Fluorescenza, umbelliferone o chelati di lantanidi Principio del saggio A) Metodi con separazione 1 1. Idrolisi anticorpo-dipendente 2. Polarizzazione della fluorescenza 3. Estinzione della fluorescenza 4. Amplificazione della fluorescenza 5. SLFIA (substrate linked fluorescent immunoassay) B) Metodi senza separazione 1. Metodi con reagenti in eccesso (IFMA) 2. Saggi per competizione di anticorpi marcati Sensibilità FITC 10-12 moli/l Chelati di lantanidi: 10-14-10-16moli/l

Vantaggi e Svantaggi dei Traccianti Fluorescenti

Vantaggi e svantaggi dei traccianti fluorescenti Vantaggi a. Si possono ottenere numerosi segnali per molecola di marcatore in seguito a ripetuta eccitazione b. Si può raggiungere una elevata sensibilità impiegando chelati di lantanidi come trac- cianti e la fluorescenza ritardata come sistema di lettura c. Si possono sviluppare saggi omogenei senza separazione Svantaggi Questi metodi sono soggetti a possibili contaminazioni che danno origine a segnali non specifici alti e variabili: la purezza dei reagenti è un punto molto critico.