Ricerca degli autoanticorpi anti-ENA, Glapa Amcli, Appunti

Introduzione agli Autoanticorpi Anti-ENA

RICERCA DEGLI AUTOANTICORPI ANTI-ENA INTRODUZIONE ENA (Extractable Nuclear Antigens) è un termine improprio ed ormai superato con cui si individuano genericamente molti antigeni sia nucleari che citoplasmatici che possono essere estratti in soluzione salina (1).

Classificazione degli ENA

Nell'ambito degli ENA si possono individuare:

• Proteine associate al DNA: istoni, gli antigeni Scl-70, PCNA, Ku, le proteine centromeriche.
• Proteine associate al RNA: U1RNP, Sm, fibrillarina, RNA-polimerasi I, NOR-90, nucleolina, SSA/Ro, SS- B/La, Jo1, PL-7, PL-12, RNP ribosomiali (6).

Si deve ricorrere alla determinazione degli anticorpi anti ENA quando la positività ANA in fluorescenza è almeno uguale o superiore al titolo 1:160. Non ha senso eseguire sistematicamente la loro determinazione al di sotto di tale titolo, ma essa è consigliata quando, in assenza di positività ANA, ci siano sintomi clinici di una malattia autoimmune.

Test di Laboratorio Raccomandati per ENA

TEST DI LABORATORIO RACCOMANDATI Per la scelta del metodo di studio degli ENA è necessario tenere presenti alcuni fattori:

• Il tipo di laboratorio che può essere di riferimento o meno.
• Il budget del laboratorio e di conseguenza il costo dei reattivi.
• L'organizzazione del laboratorio.
• L'esperienza e la manualità del personale addetto.
• Il dialogo continuo tra laboratorio e clinico.
• Il metodo di dosaggio dovrebbe possedere caratteristiche di sensibilità e di specificità ottimali, ma essendo ciò difficilmente realizzabile si rende necessario l'impiego di più di un metodo per la determinazione di questi anticorpi.

Metodi di Laboratorio Impiegati

I metodi di laboratorio attualmente impiegati sono:

• IDD (Immunodiffusione doppia) Consiste in una diffusione passiva degli antigeni e degli anticorpi in gel di agarosio (15). La risposta positiva si manifesta con la comparsa di linee di precipitazione. Non necessita di alcuna strumentazione e la specializzazione richiesta dell'operatore è minima. Il tempo di preparazione del test è ridotto, ma l'incubazione dura da 24 a 48 ore. Il tipo di dosaggio è qualitativo; la sensibilità è scarsa, mentre la specificità è buona. La riproducibilità è scarsa. L'interpretazione dei risultati è soggettiva. È un metodo piuttosto conveniente e può essere usato come tecnica di routine.
• CIE-PDS (Controimmunoelettroforesi-fosfododecilsolfato) SI tratta di un'elettroforesi eseguita su gel di agarosio (8). La risposta positiva si ha dalla comparsa di linee di precipitazione. È richiesta una camera per elettroforesi ed il grado di specializzazione richiesto è moderato. Il tempo di preparazione del test è di un'ora, ma l'incubazione dura 4 ore. Il tipo di dosaggio è semiquantitativo. Sia la sensibilità che la specificità sono buone. La riproducibilità è moderata ed è legata alla manualità dell'operatore. L'interpretazione del risultato è soggettiva. Si tratta di un metodo rapido, ma difficoltoso. È sconsigliato per il dosaggio di anticorpi anti-Scl70 essendo questi un antigene caricato negativamente rispetto agli altri antigeni.
• ELISA (Immunoenzimatico) In questo metodo l'antigene è adeso alla fase solida. In ELISA, la risposta è colorimetrica ed il risultato può essere sia qualitativo che quantitativo. La sensibilità, la specificità, la riproducibilità e l'interpretazione dei risultati sono buone. È un metodo conveniente ed è considerato di routine. È più sensibile di ID e di CIE. Con questa tecnica si possono avere fino al 50-60% di cross-reattività tra nRNP ed Sm. Per il dosaggio degli anticorpi anti-rP il metodo ELISA è quello di riferimento.

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• IB (Immunoblotting) Il metodo si basa sulla tecnica SDS-PAGE. La risposta è colorimetrica; la strumentazione richiesta consiste in una camera per elettroforesi e blotting. Il grado di specializzazione dell'operatore deve essere molto alto. Il tempo di preparazione è di 2 ore e quello di dosaggio è di 36-48 ore. Il risultato è di tipo qualitativo. La sensibilità e la specificità sono buone, mentre la riproducibilità è moderata e dipende dall'operatore. L'interpretazione del risultato è soggettiva. È una metodica sensibile ma delicata ed è riservata ad operatori esperti. Lo spettro anticorpale è ridotto rispetto a quello rilevabile con la tecnica WB. Ci possono essere problemi per l'idividuazione di anti-Scl70 a causa della labilità della molecola antigenica sensibile alle proteasi in fase di estrazione.
• WB (Western blot) Il metodo si basa sulla tecnica SDS-PAGE (16). La strumentazione può essere automatica. Il risultato è di tipo qualitativo e la lettura è soggettiva e di difficile interpretazione. Questo metodo consente l'identificazione di un grande numero di anticorpi compresi quelli più rari. Ci possono essere problemi per l'idividuazione di anti-Scl70 a causa della labilità della molecola antigenica sensibile alle proteasi in fase di estrazione.
• DB (Dot blot) Gli antigeni purificati sono blottati su strisce di nitrocellulosa. Il dosaggio è abbastanza rapido (circa 30') e semplice. Il risultato è qualitativo e la lettura è soggettiva. Il pattern anticorpale è ridotto.

NB: Per la ricerca degli ENA il sistema più diffuso è la metodica immunoenzimatica con la quale si determinano i 6 antigeni principali (Sm, U1RNP, SS-A, SS-B, Jo-1, SCL-70). Per gli altri antigeni estraibili, la determinazione è effettuata con metodiche quali WB, DB o ELISA laddove esista il kit appropriato.

Osservazioni sulla Rilevazione degli Autoanticorpi

OSSERVAZIONI In conclusione possiamo dire che attualmente:

• Esiste una certa difficoltà di rilevazione degli anticorpi anti-Sm, anti-Scl70, anti-Jo1 dovuta sia alla labilità antigenica, sia alla difficoltà di legarsi a supporti solidi.
• Il metodo WB dovrebbe essere utilizzato come metodo di conferma di IDD, CIE, ELISA, DB.
• Considerando che attualmente le tecniche maggiormente impiegate per ottenere gli antigeni purificati sono di due tipi, ricombinanti ed estrattive, ne consegue che si possono avere diverse sensibilità e specificità e precisione analitica nell'ambito di uno stesso metodo di dosaggio a seconda che l'antigene impiegato sia stato ottenuto con l'una o con l'altra tecnica. A tal proposito, sono indicati sia gli antigeni estrattivi che quelli ricombinanti, anche se questi ultimi sembrerebbero mantenere gli epitopi antigenici allo stato nativo. Bisogna tener presente che anche il diverso tipo di supporto a cui sono adesi gli antigeni influisce sulla sensibilità e la specificità del metodo di dosaggio.
• Per tutti questi motivi pensiamo che una tecnica da sola non sia sufficiente ad individuare correttamente tutti i principali autoanticorpi, e che sia utile invece avere a disposizione un secondo metodo di conferma che potrebbe essere individuato nel WB, anche se è una tecnica piuttosto indaginosa e richiede una certa esperienza sia nell'esecuzione che nell'interpretazione dei risultati.

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Autoanticorpi Significativi per Diagnosi e Monitoraggio

AUTOANTICORPI PIÙ SIGNIFICATIVI DAL PUNTO DI VISTA DIAGNOSTICO E DEL MONITORAGGIO:

1) Autoanticorpi Anti-SS-A/Ro

L'antigene SS-A è una piccola ribonucleoproteina costituita da una molecola di RNA e da due proteine. Gli anticorpi sono diretti verso epitopi che si trovano sulle proteine. Questo antigene gioca un ruolo nel processo di traduzione del mRNA a molecole attive. È localizzato principalmente nel nucleo, ma si può trovare anche nel citoplasma.

Significato Diagnostico degli Anticorpi Anti-SS-A/Ro

• Gli anticorpi diretti verso entrambe le proteine da 52 e 60 kDa (2) si trovano sia nella Sindrome di Sjögren, sia nel LES.
• Gli anticorpi diretti esclusivamente contro la proteina di 52 kDa si trovano nella Sindrome di Sjögren e nel blocco atrio-ventricolare congenito.
• Gli anticorpi diretti esclusivamente contro la proteina di 60 kDa si trovano solo nel LES.
• Anticorpi anti-SS-A si trovano nel 50% dei casi di LES. Possono essere trasmessi al feto attraverso la placenta e causare una semplice reazione infiammatoria o causare un blocco cardiaco congenito nel neonato.

Pertanto in fase diagnostica, si consiglia il dosaggio di questi anticorpi per l'individuazione della patologia.

Tabella Autoanticorpi Anti-SSA/Ro

AUTOANTICORPI ANTI - SSA/Ro

Pattern ANA (IFI): titolo di partenza significativo Tipo di dosaggio Utilità Cadenza Tecnica di dosaggio consigliata Motivazione 1:160 Fine speckled Qualitativo

• Diagnosi di Sindrome di Sjögren, LES Una sola volta IDD
• Semplice Affidabile
• Automatizzabile
• Blocco atrio- ventricolare congenito ELISA
• Semplice, di routine
• Buona sensibilità
• Conveniente IB
• Facile interpretazione DB
• Rapida
• Semplice

2) Autoanticorpi Anti-SS-B/La

L'antigene SS-B è una fosfoproteina (13) localizzata principalmente nel nucleo, soltanto il 10% dell'antigene può trovarsi nel citoplasma. Nel nucleo, l'antigene si comporta da proteina ausiliaria per I'RNA polimerasi III enzima che sintetizza piccole molecole di RNA. Durante la trascrizione, l'antigene SS-B si unisce alle molecole di RNA neoformate, dopo di che viene rilasciato.

Significato Diagnostico degli Anticorpi Anti-SS-B/La

• Gli anticorpi anti-SS-B si ritrovano praticamente solo in donne affette da Sindrome di Sjögren o da LES.
• Nella Sindrome di Sjögren gli anticorpi anti-SS-A e anti-SS-B si ritrovano quasi sempre contemporaneamente.
• Gli anticorpi anti-SS-B sembrano essere associati ad un coinvolgimento renale del LES (nefrite lupica).

Pertanto in fase diagnostica, si consiglia il dosaggio di questi anticorpi per l'individuazione della patologia.

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Nota sugli Antigeni SS-A/Ro

NOTA: L'antigene SS-A/Ro esiste sotto forma nativa, purificata o sotto forma ricombinante, utilizzato nei Kit nelle forme isolate SS-A 52 KDa e SS-A 60 KDa o come cocktail SS-A 52 KDa+SS-A 60 Kda. Gli autoanticorpi che riconoscono tali diversi epitomi non sono gli stessi e non presentano le stesse correlazioni cliniche. A seconda del tipo di Kit commerciale utilizzato si potranno, pertanto, avere risultati diversi e discordanti da quelli ottenuti con l'uso di altri Kit.

Tabella Autoanticorpi Anti-SSB/La

AUTOANTICORPI ANTI - SSB/La

Pattern ANA (IFI): titolo di partenza significativo Tipo di dosaggio Utilità Cadenza Tecnica di dosaggio consigliata Motivazione 1:160 Fine speckled Qualitativo

• Diagnosi di Sindrome di Sjögren, LES Una sola volta IDD
• Semplice Affidabile
• Automatizzabile
• Nefrite lupica ELISA
• Semplice, di routine
• Buona sensibilità
• Conveniente IB
• Facile interpretazione DB
• Rapida
• Semplice

3) Autoanticorpi Anti-Scl70

L'antigene Scl70 è una proteina nucleare identificata come l'enzima DNA-topoisomerasi I (7) la cui funzione consiste nello svolgimento della doppia elica del DNA in fase di trascrizione.

Significato Diagnostico degli Anticorpi Anti-Scl70

• Gli anticorpi anti-Scl70 sono presenti in circa il 30-40% dei pazienti affetti da sclerodermia sistemica progressiva, di cui sono marker specifico.
• La contemporanea negatività per anti-Scl70 ed anti-centromero esclude la sclerodermia.
• Non c'è correlazione tra la loro concentrazione e l'andamento della malattia.

Pertanto in fase diagnostica, si consiglia la loro determinazione per l'individuazione della patologia. Una volta però che siano stati trovati in un paziente, non è di alcuna utilità rifare il test nel tempo, perché non esiste variazione per questo tipo di anticorpi, per cui non sono utili nel monitoraggio della malattia.

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