Cromatografia: Il Cromatogramma, parametri e equazione di Van Deemter

Il Cromatogramma

Chimica analitica e strumentale AS 2020-21 Cl 5 ECHNelle tecniche strumentali, qualunque sia la tipologia di cromatografia, lo strumento restituisce un CROMATOGRAMMA Il CROMATOGRAMMA è il grafico del segnale fornito dal rivelatore in funzione del tempo di analisi.

0.6 0,5 0,4 - 0,3 0,2 0,1 -5 5 15 20 -0,1

Il cromatogramma è composto dalla linea di base (cioè il segnale della fase mobile in assenza di campione) e dai picchi cromatografici dovuti agli analiti che escono dalla colonna.Un PICCO cromatografico è caratterizzato da tempo di ritenzione - e il tempo impiegato tra l'iniezione del campione e la registrazione del massimo del picco; - dipende dalla natura della sostanza, dalla colonna e dalle condizioni operative; - è fondamentale per le analisi qualitative.

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 -5 5 10 15 20 -0,1 area del picco - e la superficie delimitata dal contorno del picco e la linea di base; - dipende dalla quantità di sostanza in uscita e dalle caratteristiche del rivelatore; - è fondamentale per le analisi quantitative.Tangenti ai punti di flesso Segnale dello strumento Picco di una sostanza non trattenuta 1,000 0,882 Punto di flesso Punto di flesso h 0,607 0,500 İ 1=2,354₾ ₩=3℃ 0,324 h/2 B D 0,134 W=56 0,044 0,000 A E Linea di base Wo 0 Tempo (minuti) Cromatogramma ideale: Curva Gaussiana paragrafo 2.4 pag 296-298 F C Altezza relativa al massimo del picco ₩i=2%Dal cromatogramma si ricavano i PARAMETRI CROMATOGRAFICI informazioni utili per valutare la "bontà" di un sistema cromatografico

Parametri Cromatografici

Selettività

E' la capacità della colonna di fornire picchi distanziati e dipende dalla lunghezza della colonna, dalla temperatura e dalla natura della fase stazionaria. bassa selettività B tempo alta selettività A B tempo

Efficienza

E' la capacità della colonna di mantenere compatta la banda di eluizione di una sostanza lungo tutto il percorso della fase mobile. Ciò significa ottenere picchi alti e stretti all'uscita della colonna: (ALTA EFFICIENZA) La cosa è di grande importanza,perche qualora due sostanze avessero tempi di ritenzione molto vicini se ne potrebbe ottenere ugualmente la separazione. Quindi, quanto piu stretti sono i picchi tanto più efficiente risulta la colonna. bassa efficienza I tempo alta efficienza A B tempo

Risoluzione Cromatografica

Questo fattore tiene conto sia della selettività che dell'efficienza, e indica il grado di effettiva separazione ottenuto per due sostanze in un processo cromatografico. Scarsa RISOLUZIONE cromatografica Picchi NON risolti 98% A 2% B 1 98% B 2% A Tempo di ritenzione Buona RISOLUZIONE cromatografica Picchi risolti 100% A 100% B Tempo di ritenzione

Dal punto di vista numerico si ottiene dalla relazione: R= Tr (B)-Tr(A) W /2+W /2 Per avere una buona separazione, dal punto di vista quantitativo, si deve avere risoluzione almeno 0,8 . Tr tempo di ritenzione W misura della base del picco, approssimando la gaussiana ad un triangoloTr(B) Tr(A) 1 4 A A 1 · WA/2 WB/2 F - tempo Esempio 1 - picchi ben separati- Tr(A)=93 Tr(B)=39 WA/2=15 WB/2=8 R= 93-39 15+8 -= 2,3 La risoluzione è buona. Le sostanze A e B sono state adeguatamente separate Tr(B) Tr(A) B A WB/2 WA/2 tempo Esempio 1 - picchi parzialmente sovrapposti- Tr(A)=53 Tr(B)=40 WA/2=16 WB/2=11 53-40 R= 16+11 =0,5 La risoluzione è insufficiente. Le sostanze A e B non sono state adeguatamente separate B

Fattori che Influenzano la Separazione

Cammini Multipli

CAMMINI MULTIPLI (con colonne impaccate) 1 Nella gas cromatografia GC si usano colonne capillari e questo fenomeno non è critico, può essere importante nella cromatografia liquida HPLC La granulometria della fase stazionaria può non essere uniforme, di conseguenza le molecole della sostanza in colonna possono percorrere cammini diversi e quindi arrivare al detector in tempi diversi Per evitare questo fenomeno le particelle della fase stazionaria deve avere una distribuzione granulometrica molto ristretta. Inoltre l'impaccamento della colonna deve essere il più omogeneo possibile

Diffusione Longitudinale

a b Banda Colonna Fase stazionaria La diffusione è lo spostamento spontaneo delle specie chimiche in miscela dovuto ai diversi gradienti di concentrazione. Nelle colonne tale diffusione avviene in senso longitudinale Dipende dal tempo di permanenza della specie nella fase mobile (quindi dal tempo di ritenzione) minore è il tempo di ritenzione minore lo slargamento Da come il soluto diffonde nella fase mobile: se la fase mobile è un gas o un liquido a bassa viscosità il soluto diffonde più facilmente e quindi si allarga la banda. Per contrastare aumentare la velocità della fase mobile, usare liquidi viscosi e gas a maggiore densità, operare a bassa temperatura. E' un fenomeno importante in GC

Trasferimento di Massa

a b Fase mobile Fase stazionaria Quando una sostanza viene immessa in colonna, si diffonde nella fase mobile Successivamente parte delle molecole si attaccano e diffondono nella fase stazionaria, mentre parte viene trascinata via dalla fase mobile. Questo processo, il trasferimento di massa tra la fase stazionaria e quella mobile e viceversa, si ripete per tratti successivi. Quanto più è veloce la fase mobile e quanto più è lento il trasferimento di massa tre le due fasi tanto più slargato è il picco. Per diminuire l'allargamento dovuto a questo fenomeno occorre diminuire la velocità della fase mobile:5 500

Equazione di Van Deemter

I tre fenomeni precedentemente descritti, possono essere riassunti matematicamente dalla seguente equazione H (cm) H = A + B/u + C.u C.u Minimum von H 1 1 A B/u optimale Fließgeschwindigkeit Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase u (cm/s) H altezza del piatto teorico A fattore legato ai percorsi multipli B fattore legato alla diffusione longitudinale C fattore legato al trasferimento di massa u velocità della fase mobile

Efficienza della Colonna e Piatti Teorici

L' EFFICIENZA di una colonna cromatografica può essere espressa anche con il numero di PIATTI TEORICI (N) Per un picco N =(~)2 tr Si definisce PIATTO TEORICO il tratto di colonna in cui una data specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (mobile e stazionaria) prima che l'eluente la trascini verso il piatto successivo. Maggiore è il numero dei PIATTI TEORICI maggiore è l'efficienza della colonna, ossia piu stretta è la banda cromatografica. Ci sono colonne che hanno fino a decine di migliaia di piatti teorici per metro Il numero dei PIATTI TEORICI può essere aumentato aumentando la lunghezza della colonna Se non si può aumentare la lunghezza della colonna si può diminuire l'altezza del piatto teorico agendo principalmente sulla velocità di flusso. QUINDI MINORE E' L'ALTEZZA DEL PIATTO TEORICO MAGGIORE E' L'EFFICIENZA DELLA COLONNA

Figure 2 Smaller particle sizes yield higher overall peak efficiencies and a much wider range of usable flow rates. 0.050 10um 0.045 0.040 5um 0.035 H 0.030 (mm) 0.025 0.020 3μm 0.015 0.010 1.9um 0.005 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 Linear Velocity, u (cm/sec) How do small particle size columns increase sample throughput? by Rick Lake, Pharmaceutical Innovations Chemist RESTEK

Fattori Chiave per un'Analisi Cromatografica Ottimale

Una buona analisi cromatografica dipende quindi da Lunghezza della colonna e diametro della colonna(compatibilmente con i tempi di analisi) Impaccamento della colonna Scelta opportuna della fase stazionaria e di quella mobile Velocità di flusso, caratteristiche chimico fisiche della fase mobile Temperatura della colonna

https://www.youtube.com/watch?v=08YWhLTjlfo https://www.youtube.com/watch?v=PV4NYBUaUrQ