Replicación del ADN: características, tipos y modelos procariotas y eucariotas

Replicación

Características funcionales del genoma

• Características funcionales del genoma
• Tipos de replicación del ADN
• Características de la replicación
• Semiconservativa
• Origen de replicación
• Síntesis simultánea
• Procariotas
• Eucariotas
• Sentido 5'- 3'
• Modelo procariota de replicación
• Iniciación
• Elongación
• Terminación
• Modelo eucariota de replicación
• Similitudes y diferencias
• Replicación de telómeros
• Unidades de replicación

Expresión génica

Características funcionales del genoma

1. Almacenar la información: Genotipo programa genético para desarrollar un organismo en el espacio y el tiempo

Cell Nucleus Chromosome ® Centromere DNA Sugar-phosphate backbone Sister chromatids Gene Cytosine Guanine Adenine Thymine

1. Copiar la información: Genotipo copia la información genética debe copiarse con fidelidad para transmitirla a las células hijas

REPLICACIÓN

1. Expresar la información: Fenotipo transformar el Genoma en Proteoma

TRANSCRIPCIÓN TRADUCCIÓN

Duplicación del genoma

Replicación de las dobles cadenas de ADN

Proceso molecular por el cual las células generan una copia completa y exacta de su genoma y se la transmiten a su descendencia, perpetuando los caracteres propios de la especie a la que pertenecen

Conservativo: ambas cadenas parentales permanecen juntas tras la replicación

Semiconservativo: la doble cadena de ADN contiene una cadena parental y otra de nueva síntesis

Dispersión: cada cadena contiene segmentos de la cadena parental y de nueva síntesis

Modelo de doble hélice de Watson y Crick " ... los puentes hidrógeno se rompen y las dos cadenas se desenrollan y separan. Cada cadena actúa entonces como una plantilla para la formación a partir de ella misma de una nueva cadena compañera, ... "

Three hypothetical mechanisms of DNA Replication

× DX Conservative

× IX x Semi-Conservative

DIX DX DX Dispersive

Original DNA strands Newly synthesized DNA strands

Replicación

Características de la replicación de la doble cadena de ADN

1. La replicación del ADN es semiconservativa
2. Se produce a partir de un único punto de origen (Ori)
3. La síntesis en ambas cadenas es simultánea (bidireccional)
4. La síntesis en las cadenas hijas es en el sentido 5'- 3'

Replicación

La replicación del ADN es semiconservativa

Experimento de M. Meselson y F. Stahl (1958)

DNA extracted and centrifuged to equilibrium in CsCI density gradient

N15 XXXXXX Heavy DNA (15N) Original parent molecule

N14 (b) Hybrid DNA (IBN/14N) nov nov First-generation daughter molecules

Light DNA (14)) (c) Hybrid DNA nov nov Second-generation daughter molecules

1. Cultivo de E. coli en un medio con el isótopo N15
2. Después de muchas generaciones de crecimiento todas las bacterias cultivadas tenían su ADN marcado con el isotopo pesado N15
3. Se mantuvo el crecimiento bacteriano cambiando a un medio que contenía el isótopo N14 de menor densidad
4. Después del cambio se extrajo el ADN de la primera generación de bacterias y se analizó la densidad de las cadenas de ADN en un gradiente de densidad de CsCl:
   • En la I generación de bacterias apareció una banda con una densidad intermedia entre N14 y N15, descartándose el modelo conservativo (b)
   • En la II generación hubo dos bandas, una intermedia y una solo de N14, eliminándose el modelo dispersivo (c)

Modelo semiconservativo: cada cadena de la molécula paterna es molde para la síntesis de una nueva cadena, en base a la complementariedad de bases

Replicación

Origen de replicación

En 1977 Yasuda e Hirota identificaron en Escherichia coli la secuencia de inicio de replicación OriC y de la proteína DnaA (Chakraborty 1982) como replicador e iniciador, respectivamente, del cromosoma bacteriano

OriC: secuencia de 245 pb con tres repeticiones de 13 ncl en tándem y cuatro sitios ricos en AT de unión a DnaA

Tandem array of three 13 bp sequences

Binding sites for DnaA protein, four 9 bp sequences

• 1

• Consensus sequence GATCTNTTNTTTT

• Consensus sequence TTATCCACA

Replicación en eucariotas (Gilbert, 2004)

Cada una de las 46 cadenas de ADN o cromosomas está conformada por varios replicones, cada uno de ellos con su secuencia de inicio Ori y su proteína iniciadora, regulándose el inicio de la polimerización a través de la interacción de ambas

Ori: en humanos no se produce en una secuencia en particular, sino que depende de la topología del DNA preferentemente en regiones con hiperenrollamiento negativo. En levaduras son secuencias cortas ricas en AT denominadas elementos ARS (autonomus replicating secuences)

Procariotas 1 Eucariotas 1 1 000000000 1 -- >8 1

Replicación

Síntesis simultánea

Se produce una burbuja de replicación o replicón que contiene dos horquillas de replicación que avanzan en sentidos opuestos

Cada una de las 46 cadenas de ADN presenta varios puntos de origen donde se forman burbujas de replicación o replicones o horquillas de replicación a lo largo de todo su tamaño

Procariotas En las células procariotas burbuja de replicar origen de replicación C horquillas de replicación

Eucariotas ori ori 0 Burbuja Burbujas Burbuja Burbuja®

Replicación en procariotas

Burbuja de replicación: Experimentos de John Cairns (1963)

• Mantuvo un cultivo de E. coli creciendo durante dos generaciones sucesivas en un medio que contenía timidina titriada (H-3), de forma que cuando las bacterias sintetizaban su ADN empleaban dicho nucleótido marcado
• Liso las células y extrajo el ADN de E. coli intacto
• Extendió el ADN sobre un portaobjetos y le hizo una autoradiografía
• La autoradiografía del ADN mostró una burbuja de replicación con dos horquillas que crecía hasta replicar totalmente el cromosoma bacteriano circular
• La replicación partía en un sitio de inicio (OriC) y se expandiría en ambas direcciones a una velocidad de 45.000 ncl por minuto a 37℃

Un único punto de origen (Ori) Dos puntos de crecimiento (PC)

PC Origen PC 1 PC Oric PC

Replicación

Horquillas de replicación adyacentes en eucariotas

• La duplicación del genoma eucarionte se lleva a cabo por horquillas de replicación adyacentes que progresan de manera bidireccional
• El tamaño de los replicones de mamífero es muy heterogéneo, de 30 a 450 kilobases (kb) del extremo de una horquilla a la otra
• Cada cromosoma eucarionte se duplica mediante la activación de miles de ORIs
• Los ORIs son reconocidos por el complejo de reconocimiento del origen (ORC) o "origin recognition complex" formado por seis proteínas
• Su unión inicia la replicación

Las unidades de replicación están organizadas en grupos que se activan sincronizadamente en diferentes tiempos durante la fase S

Cell Cycle Original cell Daughter cells

Genes eucromatina F Fase S temprana

Stages of the cell cycle M = mitosis S = DNA synthesis G1 = gap 1 G2 = gap 2 M G2 G1 DNA synthesis take place in S S

ADN repetido heterocromatina Fase S tardía T +

La iniciación de la replicación está restringida a una vez por origen de replicación y por ciclo celular

Replicación

Sentido 5'- 3'

• Cadena de ADN lider se sintetiza en forma continua
• Cadena retrasada se sintetiza en forma discontinua en "fragmentos de Okazaki"

La dirección de síntesis de la horquilla es diferente a la dirección de síntesis de la hebra discontinua

3 5' Leading strand

horquilla de replicación: vértice donde se va abriendo la doble hélice

Direction of movement of replication fork

3' 5' 3' 5' Okazaki fragments 5.3. 3' Lagging strand 5'

• Semiconservativa
• Un origen y dos puntos de crecimiento (replicón)
• Bidireccional en horquillas de replicación
• La síntesis de las cadena hijas es en sentido 5'-3'

Replicación

Modelo de replicación en procariotas (E. coli)

INICIACIÓN

• Reconocimiento de orígenes de replicación
• Separación de hebras
• Posicionamiento de la maquinaria transcripcional

ELONGACIÓN

• Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación
• Replicación semicorservativa
• Replicación semicontinua coordinada

TERMINACIÓN

• Reconocimiento de señales de terminación
• Desensamblaje de replisomas

Fase de iniciación: Desenrollamiento

Conjunto de proteínas que abren la doble hélice en el ORI

1. DnaA separan las dos cadenas de ADN a partir del OriC
2. Helicasa se une a la cadena retrasada en ambas horquillas y rompe los puentes de hidrogeno entre las bases complementarias con consumo de ATP
3. Proteínas enlazantes de ADN de cadena única (single-strand-binding protein SSBs) recubren las dos cadenas sencillas y las mantienen separadas
4. ADN girasa es una topoisomerasa tipo II que corta las dos cadenas de ADN eliminando la tensión y los superenrollamientos delante de la horquilla

ori Proteína Iniciadora DnaA 1 INNNNNNVV 2 helicasa Helicase

SSB son cuatro proteínas que se unen a segmentos de ADN simple o doble de 35 a 65 ncl independientemente de su secuencia

Single-strand-binding proteins SSB 3 4 girasa Origin Unwinding DNA gyrase DNA helicase Unwinding Single-strand- binding proteins Unwinding Unwinding

Helicasa y Girasa

HELICASA

• Separación de las dos cadenas de ADN
• Genera superenrollamiento (+)

DNA helicase binds KADPIA ATP K - ATP - ADP & P1 K ATP ADP + P AAAA

GIRASA o Topoisomerasa II

• Relaja la tensión generado por la helicasa
• Genera superenrollamiento (-)
• ATP dependiente

8- Gyrase ATP DNA containing one positive supercoil - DNA containing one negative supercoil ADP HP +P A - $

Diana de Antibióticos

• Novomicina
• Quinolonas (Ac. Nalidíxico)
• Ciprofloxacina

ADN polimerasas

Las ADN polimerasas en presencia de un primer de ARN "detonante replicativo" y dNTPs (precursores nucleotídicos) sintetizaban una cadena de ADN nueva in vitro (A. Kornberg, 1959)

Tres ADN polimerasas en la replicación

ADN pol I 109 kD, monomérica (Kornberg)

• Elimina los primers ARN (exo 5'a 3')
• Incorpora de 10 a 20 nl (pol 5'a 3')
• Reparación (exo 3'a 5')

ADN pol II 90 kD, monomérica

• No participa en la síntesis de ADN
• Reparación (exo 3'a 5')
• Lenta 850 nl en7minuto

ADN pol III 900 kD, heteromultimérica

• Cataliza la replicación del ADN (pol 5'a 3')
• Requiere primer de ARN
• Puede añadir hasta 1000 nl
• Reparación (exo 3'a 5')

DNA polymerase P OH catalysis P P P P OH primer 5 3º A T T c base pairing G A A G A A T template 3' HO P P P P P P P P P P

• Necesitan primers ARNs de 7 a 10 nl complementarios del extremo 3'de la cadena molde
• Solo pueden unirse al 3'OH de la desoxirribosa

Cebador(primer) ARN 5'-P T 73'-OH 3'-OHL 5'-P DNA molde T c c 5