Pcr a Tiempo Real: ventajas y aplicaciones en biología molecular

PCR a Tiempo Real

Amplification Plot 29 25 20 35 40 Cycle IES Moratalaz Biología Molecular

Contenido

• ¿ Cómo se realiza la cuantificación?

Fundamento y cinética de la amplificación Sistemas de detección. Tipos de fluoróforos Fluoróforos genéricos

• Fluoróforos específicos. Principio FRET
  • Sondas de hidrólisis Balizas moleculares
  • Sondas FRET

Aplicaciones de la TR-PCR

• Análisis cuantitativo
• Cuantificación absoluta
• Cuantificación relativa. Determinación de la expresión génica Determinación de mutaciones mediante curvas de fusión

.

Análisis de las curvas de disociación (curvas de melting o de fusión) de los productos amplificados por PCR

• Otras aplicaciones de la TR-PCR

Comparación entre PCR tradicional y PCR-TR Videos Actividades IES Moratalaz Biología Molecular

Introducción a la PCR a Tiempo Real

La PCR estándar se considera reacciones a punto final. Es decir, el resultado de la reacción no se conoce hasta que no termina y se analizan sus productos mediante electroforesis.

En la PCR a tiempo real o cuantitativa (Q-PCR y PCR-TR) , en cambio, se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo.

En la actualidad es la técnica más sensible para la detección de ADN y ARN.

La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real, que, además de las funciones típicas de un termociclador convencional, incorpora un lector de fluorescencia, de manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR. IES Moratalaz Biología Molecular

Ventajas de la PCR a Tiempo Real

Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a punto final son evidentes:

Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya que el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR.

Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es más objetiva y sensible que la tinción con bromuro de etidio de un gel de electroforesis.

Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la detección se realizan en el mismo tubo cerrado. No hay necesidad de hacer electroforesis

Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la PCR a tiempo real permite la cuantificación (tanto de los amplicones producidos, como del ADN diana inicial presente en la muestra). Es decir, con Q-PCR y RT-PCR se puede determinar el nº de copias o la cantidad relativa de una determinada secuencia de DNA ADNc o RNA. IES Moratalaz Biología Molecular

Lector de Fluorescencia en Termociclador

Se incorpora al termociclador un lector de fluorescencia que permite, durante la amplificación, medir la cantidad de ADN sintetizado en cada momento (la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado).

Es posible evaluar y registrar en todo momento, la cinética de la reacción de amplificación. IES Moratalaz Biología Molecular

Cuantificación en PCR a Tiempo Real

Se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido.

La cuantificación se produce mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón. Tproducto I fluorescencia que se emite

Los termocicladores a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los softwares de análisis representan dicha fluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. IES Moratalaz Biología Molecular

Fundamento y Cinética de la Amplificación

Para estudiar la cinética de la amplificación de la PCR, se utilizan las llamadas curvas de amplificación.

La curva de amplificación relaciona cantidad de fluorescencia con la producción de amplicones.

Es una curva de tipo sigmoide, que se obtiene al representar la emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR, respecto del número del ciclo en que se produce. IES Moratalaz Biología Molecular

Fases de la Curva de Amplificación

La curva de amplificación es sigmoidea y tiene cuatro zonas claramente diferenciadas, que corresponden a tres fases de la cinética de amplificación: Fase de ruido, basal o inicial. Fase de crecimiento exponencial o geométrica. Fase lineal Fase de meseta (Plateau) Curvas de amplificación de la Q-PCR Fase estacionaria Fase lineal MUESTRA 000 Fluorescencia Fase promclics- umbral - - - Linea base. BLANCO Ciclos Cada curva es una muestra IES Moratalaz Biología Molecular

Zona de Ruido en Curva de Amplificación

La única fluorescencia que se detecta es debida a la señal fluorescente de fondo en cada tubo. Es decir, no hay cambios significativos en la intensidad de fluorescencia emitida, por lo que es indistinguible el ADN amplificado y el ruido basal. Cuando se comienzan a preciar cambios en la emisión de fluorescencia, se marca la línea umbral (= línea Threshold). Corresponde a los primeros ciclos de PCR, 10-15, en los que el número de amplicones sintetizados está por debajo del nivel de detección del termociclador y, por lo tanto, lo está la fluorescencia asociada a ellos.

La amplitud de esta zona de la curva va a depender de la cantidad inicial de la secuencia diana en la muestra.

Cuanto menor es el número de secuencias diana en la muestra, más ciclos se necesitan para obtener un número de amplicones por encima del nivel de detección del aparato.

Con esta fase queda delimitada la línea base. IES Moratalaz Biología Molecular

Zona de Crecimiento Exponencial

En esta fase los reactivos de la reacción son abundantes, por lo que la reacción se asume que tiene una eficiencia cercana al 100% (que no suele suceder; la eficiencia suele ser de 80-85%).

El producto se duplica en cada ciclo (2", asumiendo100% de eficiencia), a partir de cada molécula de ADN se generan dos.

La curva en esta zona es lineal y de gran pendiente.

Abarca un número reducido de ciclos (de 4 a 6) y corresponde a la auténtica fase exponencial de producción de amplicones.

La reacción es muy específica y reproducible. A B C Fluorescencia Umbral Nº de ciclos Fig. 6.12. Curva de amplificación caracteristica de una PCR a tiempo real. A) Zona de ruido, correspondiente a los ciclos en los que la cantidad de amplicón especifico se en- cuentra por debajo del limite de detección del termocicla- dor (umbral). B) Zona de crecimiento exponencial. C) Zona de meseta. IES Moratalaz Biología Molecular

Zona Lineal de Amplificación

Corresponde al momento en que los reactivos comienzan a ser limitantes en la reacción y se presenta un decaimiento de la actividad enzimática (agotamiento de sustratos, pérdida progresiva de la actividad polimerasa, saturación de la enzima, etc. )

La eficiencia de la amplificación es inconstante.

En esta zona la curva es también lineal, pero de pendiente reducida. IEȘ Moratalaz Biología Molecular

Zona de Meseta (Plateau)

En esta zona la curva muestra una señal saturada.

La amplificación se detiene debido a que los componentes de la reacción se agotaron.

La cantidad de producto obtenida es constante aunque se incremente el número de ciclos. IES Moratalaz Biología Molecular

Curva de Amplificación y Ciclo Umbral

CURVA DE AMPLIFICACIÓN - ..... 800 200 000 Fluorescencia 400 100 Threshold: Umbral de detección de fluorescencia, Es el momento en donde la fluorescencia por la detección sobrepasala fluctescencia basal del sistema 100 100 0 100 100 0 Ciclo Ct (threshold cycle); Es el numero de ciclo en el cual la fluorescencia alcanza el threshold fijado. Estas curvas son producidas, por el termociclador a tiempo real, para cada reacción. Se necesita añadir a la mezcla de reacción un sistema fluorescente de detección de los amplicones. IES Moratalaz Biología Molecular

Medición de Fluorescencia y Punto de Corte

La fluorescencia se mide en la fase de crecimiento exponencial.

Para calcular la cantidad inicial de AN (ADN o ADNc) en una muestra, el termociclador a tiempo real detecta el ciclo de PCR, en el cual la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del umbral (=Threshold). Este ciclo se denomina punto de corte, Cp (Crossing point) o ciclo umbral, Ct (Threshold cycle) o Cq. Es el número de ciclo, dentro de los límites de la fase exponencial, en el que se considera que comienza la amplificación. IES Moratalaz Biología Molecular

Baseline y Threshold en PCR

28 32 Baseline: Son los ciclos iniciales del PCR, en el cual el cambio en la señal de fluorescencia es minimo

Ajuste de la Línea Threshold

La línea Threshold la fija el usuario para todas las muestras igual.

El valor de Ct puede ser asignado de manera automática por el Software del equipo mediante diferentes algoritmos o bien se puede asignar de forma manual.

Ct puede ser afectado por las características del equipo, los filtros, la lámpara .... por lo que no es posible comparar valores de Ct entre diferentes experimentos o equipos. IES Moratalaz Biología Molecular

Relación entre Cp y Cantidad Inicial de Molécula Diana

4.51 4.01 Más copias 3.51 Menos copias Fluorescence 2.5. 2.01 1.5 1.0. Sin detectar 0.5 01 0.5+ 0 2 22 24 26 28 00 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 Cycle number IES Moratalaz Biología Molecular

Cálculo de Diferencias en Cantidad de Moléculas

En la curva de amplificación, el Cp es el ciclo en que la curva alcanza un umbral en la señal de fluorescencia.

El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de una molécula diana en ella.

Cuanto mayor sea el número de secuencias diana en la muestra, menos ciclos de PCR serán necesarios para alcanzar el Cp.

Por tanto, la comparación de los Cp de las muestras permite calcular la diferencia en la cantidad inicial de las moléculas de ADN o ADNc. A partir de este valor se puede calcular la cantidad de ADN o ARNm y ello se hace teniendo en cuenta la eficiencia de la amplificación que nos habla de la fiabilidad de nuestra cuantificación. IES Moratalaz Biología Molecular

Fases de PCR en Vista Logarítmica

Plateau Ethidium-Gel detection Linear Variable yield Log [DNA] Exponential Cycle # Figure 3 shows three replicates of a sample. The replicates have the same starting quantity. As the PCR reaction progresses, the samples begin to amplify in a very precise manner. Amplification occurs exponentially, that is a doubling of product (amplicon) occurs every cycle. This type of amplification occurs in the exponential phase. Exponential amplification occurs because all of the reagents are fresh and available, the kinetics of the reaction push the reaction to favor doubling of Figure 4: PCR Phases in Log view Traditional PCR de tection Area of Detection for Real- Time. Linear High Variability Plateau Ethidium-Gel Detection Log [DNA] Exponential High precision Cycle # IES Moratalaz Biología Molecular