Introducción a los Cultivos Celulares, Universidad

Introducción a los Cultivos Celulares

Los cultivos de células son técnicas mediante las cuales se pueden mantener células y fragmentos de tejido en situación de aislamiento de un organismo pluricelular. Se pueden obtener de animales o vegetales. Los cultivos se obtienen haciendo crecer in vitro células dispersas, que se pueden obtener mediante disgregación mecánica. También existen cultivos tridimensionales. Los cultivos tienen aplicaciones diagnósticas, industriales y terapéuticas.

Los cultivos celulares permiten controlar las condiciones físico-químicas de cultivo y se homogeniza el comportamiento celular. Como desventaja, si se mantiene la célula en cultivo durante mucho tiempo va aumentando la inestabilidad genética, además de requerir un instrumental y entrenamiento técnico que implican un mayor coste económico.

Historia de los Cultivos Celulares

Los cultivos de tejidos se empezaron a utilizar a principios del siglo XX. En 1885, Roux consiguió mantener células embrionarias vivas en soluciones salinas, pero no fue hasta 1907 que Harrison elaboró los primeros cultivos celulares. Colocando un fragmento de médula espinal sobre un cubre y rodeándolo de linfa hasta que se coagulara, creó un sistema que permitía, en ciertas condiciones ambientales, la supervivencia de las células y su crecimiento. Se denominó técnica de la gota pendiente. También destacan los trabajos de Carrel en 1913, que con el objetivo de tener material para trasplantes, cultivó muchos tipos de explantes. Experimentó con diferentes medios: linfa o plasma mezclados con soluciones salinas y extractos de embriones de pollo. Tambien contribuyó a formar el concepto de asepsia, para mantener el cultivo esterilizado, mediante el desarrollo de esterilizantes y de un matraz de fondo plano con cuello inclinado para evitar los derrames, muy similares a los frascos que se utilizan en la actualidad.

En los años 40-50, debido a las epidemias de polio, se estaba trabajando en la vacuna contra la enfermedad. En estos estudios se empezaron a utilizan antibióticos para mantener cultivos asépticos. Enders, en 1949, consiguió replicar el virus de la polio en células no humanas, en cultivo. En 1954, Salk utilizó riñones de mono, infectándolas con el virus de la polio, para generar la vacuna. La vacuna de la polio fue el primer producto comercial de uso humano obtenido de cultivos de células de mamífero. Se obtuvo a partir de un cultivo primario, un tipo de cultivo preparado a partir del organismo directamente. Para mantenerlo vivo y proliferativo es necesario un subcultivo, generando cultivos nuevos que formar una línea celular primaria o cepa celular. Llega un momento, al llegar a las 50 generaciones de media, las células mueren porque entran en senescencia y dejan de crecer. Por tanto, las líneas celulares primarias presentan una vida finita en cultivo.

En 1952, Gey tomó una biopsia de cáncer y colocó las células en cultivo, observando que proliferaban indefinidamente, generando la línea HeLa, el primer ejemplo de línea celular transformada humana. Una línea celular transformada contiene células que han sufrido un cambio genético que les permite un crecimiento indefinido, no entran en senescencia. En la actualidad, para la producción de vacunas se pueden utilizar cultivos primarios de embriones de pollo, a partir de los fibroblastos. Así se obtuvo la vacuna de la gripe o de la rabia. Tambien se utilizan líneas primarias humanas y líneas continuas humanas,diseñadas mediante ingeniería genética, que se han utilizado para el desarrollo de la vacuna del Covid-19.

Otra contribución importante fue la de Eagle, en 1955, que hizo el primer estudio sistemático de los requerimientos nutricionales de las células en cultivo. Desarrolló el primer medio definido. En la década de los 70-80 se desarrollaron hibridomas para producir anticuerpos monoclonales o la tecnología del ADN recombinante para la producción de proteínas de interés. Una de las primeras que se obtuvo fue la insulina. En un principio se utilizaron bacterias, pero al no ser eucariotas no podían hacer ciertas modificaciones post-traduccionales. Por eso se intercambiaron por levaduras y finalmente, por células de mamífero. En los años 90 se aislaron las primeras células madre en cultivo y se empezaron a desarrollar las tecnologías de cultivos 3D.

Aplicaciones de los Cultivos Celulares

Los cultivos celulares tienen varias aplicaciones:

• Investigación de la fisiología y bioquímica celular
• Detección de compuestos potencialmente tóxicos o mutagénicos
• Terapia celular y medicina regenerativa: se utilizan células de cultivos para introducirlas en organismos vivos para sustituir tejidos dañados. Por ejemplo, los cultivos de condrocitos autólogos se utilizan en personas sanas que tengan un accidente y acaben con parte del cartílago sano y parte del cartílago lesionado. En estos casos se toma una biopsia de cartílago sano y se cultivan las células entre 2 y 6 semanas. Estos nuevos condrocitos se reinsertan en el cartílago dañado, lo colonizan y empiezan a secretar nueva matriz, hasta restaurar el cartílago. Al ser autólogo no hay rechazo.
• Obtención de productos de interés: vacunas, proteínas de uso terapéutico y anticuerpos monoclonales.

Métodos de Inicio de los Cultivos

Los métodos de inicio dependen de si las células que vamos a cultivar tienen alta o baja adherencia. El organismo de origen puede ser un individuo adulto, un embrión o un huevo embrionado. A partir de ahí se obtiene un fragmento de tejido y se disecciona en fragmentos pequeños. Para generar un cultivo celular, de células dispersas, estos fragmentos se tratan con enzimas que eliminen las uniones entre las células, que suelen ser de tipo proteico. La digestión enzimática permite obtener una suspensión celular, y esas células se siembran en un frasco adecuado con medio líquido. De tratarse de células adherentes, se unen a la superficie. Cuando entran en mitosis se separan para dividirse, pierden la adherencia, y las células hijas la vuelven a ganar al entrar en interfase. Con el tiempo las células van cubriendo la superficie, generando confluencia. Si se mantiene durante mucho tiempo las células entran en senescencia, por lo que para evitarlo se generan subcultivos antes de que las células lleguen a la confluencia. En estos cultivos se tiene un medio líquido y un sustrato sólido, el plástico de la pared del frasco.

Al cabo de varios subcultivos, van a predominar las células que mejor se adapten, con lo que el cultivo se vuelve más homogéneo y es la mejor etapa para realizar experimentos. Para la disgregación enzimática se utiliza muchas veces la tripsina, pero también pronasa, colagenasa o dipasa. Tripsina y pronasa son bastante efectivas, por lo que se mantienen durante poco tiempo para que no dañen la superficie de la célula. Colagenasa y dipasa son menos efectivas y también menos tóxicas.

En el cultivo suelen predominar los fibroblastos, por lo que para obtener otros tipos celulares, como las células epiteliales, hay que variar las condiciones de cultivo.

Otra técnica de cultivo implica que a partir de la primera disección, se hacen disecciones más finas para obtener directamente los explantes. También se genera confluencia en estos casos. Cuando esté recubierto, se eliminan los explantes para formar el cultivo de células disgregadas. Se utiliza un método u otro dependiendo del tipo celular o del organismo de origen.

En algunos casos interesa cultivar el propio fragmento de tejido, formar un cultivo tridimensional. En estos casos a partir de la primera disección se llevan el fragmento de tejido hasta un medio que mantenga las estructura del tejido, manteniendo la interacción entre las células y con la matriz. Para conseguirlo, se utilizan distintos soportes como rejillas o matrices tridimensionales que detienen la interacción entre las células. Estos cultivos no se pueden propagar, no se pueden generar subcultivos. El sustrato puede ser semisólido, y el medio sigue siendo líquido, al igual que en los cultivos celulares.

En el caso de las células no adherentes, como las células sanguíneas, se extrae la muestra y se mezcla con medio de cultivo, donde las células crecen en suspensión, sin adherirse a la pared del frasco. En estos casos el medio es líquido y el sustrato también es líquido, porque es el propio medio.

Tipos de Cultivos en Células Animales

Se pueden generar distintos tipos de cultivos en células animales:

• Cultivos de tejidos y órganos
• Cultivos de células disgregadas o dispersas
• Cultivos histotípicos: se obtienen a partir de células que crecen en un sistema convencional, y se llevan las células a un sistema de cultivo en el que se reorganicen y reconstruyan la estructura tridimensional.
• Cultivos organotípicos: similar a los histotípicos pero utilizando varias tipos celulares distintos, con lo que se acaba generando una estructura similar a un órgano.
• Organoides: estructuras que provienen de la diferenciación de células madre. Al colocarse estas células madre en un ambiente de cultivo adecuado, con geles tridimensionales como soporte, estas células se dividen dando diferentes linajes celulares, y reconstruyen un órgano en miniatura. Lo más importante en estos caso es el tipo de factores que se utilizan, para que la célula madre responda diferenciándose sus células hijas en el tipo celular deseado.

Origen de un Cultivo Celular

Como origen de un cultivo, se pueden utilizar células epiteliales, células del tejido conjuntivo, células de la sangre, musculares, nerviosas (la propagación de neuronas no se suele conseguir, pero sí su mantenimiento o el crecimiento de células de glía o de células de neuroblastoma), células madre embrionarias o células madre adultas. Las células madre embrionarias provienen de embriones en estado de blastocisto, de la masa celular interna. Por tanto, ha habido una pequeña diferenciación en las células, generando células madre pluripotenciales. También existen células madre germinales embrionarias, que provienen del estado de gástrula, donde aparecen unas estructuras denominadas primordios germinales que contienen células con la misma capacidad de diferenciación que las células madre embrionarias.

Para poner en marcha un cultivo no siempre es necesario generar cultivos primarios, sino que existen bancos de células donde se pueden comprar tipo de células concretos y utilizarlos para experimentación. Los dos más importantes son la ATCC, la colección americana, y la ECACC, la colección europea.

Condiciones de Esterilidad y Seguridad en el Laboratorio

Para trabajar con cultivos es necesario mantener en el laboratorio unas condiciones de esterilidad y seguridad. La esterilidad se consigue mediante cabinas de flujo laminar, que permiten manipular las células sin que haya riesgo de contaminación. También se utilizan incubadores de dióxido de carbono y microscopios invertidos. La cabina de flujo laminar mantiene un ambiente estéril en su interior gracias a un dispositivo de luz ultravioleta tipo C, que es germicida. Así se esteriliza el interior. Además está equipada con filtros HEPA, filtros de alta eficiencia, por lo que pasa el aire antes de entrar en la cabina para que se retengan las partículas y se cree una cortina de aire no turbulento. Así el interior se mantiene estéril durante el tiempo. Hay dos tipos de cabinas, horizontal o vertical. En la horizontal el flujo de aire es horizontal al espacio de trabajo, mientras que la de flujo vertical se forma una cortina de aire estéril perpendicular a la superficie de trabajo. La horizontal mantiene mejor la esterilidad, pero la de flujo vertical minimiza el número de sustancias que alcanzan al usuario y que salen al exterior, por lo que es la que se utiliza en el cultivo de células.

El riesgo de trabajar con cultivos puede provenir de que las células tengan algún tipo de patógeno. Muchos patógenos tienen barreras específicas de especie, por lo que el riesgo será mayor mientras más cercanas evolutivamente sean las células del cultivo, especialmente si son células humanas o de primates. Hay riesgo también en células marcadas con isótopos radiactivos y células tumorales. Para eliminar estos riesgos se definen tres tipos de cabinas de seguridad biológicas: clase I, extractora de gases; clase II, flujo laminar vertical; y clase III, completamente sellada. Se define una cabina de seguridad biológica como aquella que protege al usuario y al medio ambiente de los riesgos derivados de trabajar con ellas. Para cultivos, la cabina de clase I no protege la esterilidad de cultivos, así que no se podría aplicar en este caso.

Para mantener las condiciones de crecimiento de las células se utiliza un incubador de CO2. Se trata de una estufa, que se mantiene a 37 °℃, que además está conectada a una bombona de CO2 para mantener la concentración interior de CO2 en un 5%, lo que permite mantener el pH del medio. Los tapones de los frascos de cultivo contienen un filtro que permite el intercambio de gases en el incubador.

El microscopio invertido es un microscopio óptico donde la fuente de luz y los objetivos están invertidos con respecto al microscopio convencional, lo que permite generar un espacio grande donde se pueda introducir una placa de Petri y observar las células vivas con un enfoque adecuado. Permite hacer un seguimiento periódico de los cultivos para buscar contaminaciones y monitorizar el ritmo de crecimiento.

Por mucho que se adecuen las condiciones de cultivo a las condiciones in vivo, siempre va a haber diferencias: no hay control endocrino ni nervioso, y en cultivo las células deben proliferar mucho más que in vivo para mantenerse vivas. In vitro, las células presentan mayor proliferación, y por tanto menor diferenciación (las células muy especializadas bajan su ritmo de división), y menos interacciones intracelulares y con la matriz. Para iniciar