Hibridación de Ácidos Nucleicos: Concepto y Bases Teóricas

HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Concepto de Hibridación de Ácidos Nucleicos

Tema 6. Parte 1 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS IES Moratalaz Biología Molecular

1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA 2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2.3 MÉTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN
3. SONDAS DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 3.1 PREPARACIÓN DE SONDAS GENÉTICAS DEL DNA 3.2 TIPOS DE GRUPOS MARCADORES E INDICADORES Y SU DETECCIÓN 3.3 PURIFICACIÓN DE SONDAS MARCADAS 3.4 FASES DE LA HIBRIDACIÓN

IES Moratalaz Biología Molecular1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA 2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2.3 MÉTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN 3 ... SONDAS DE HÍBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 3.1 PREPARACIÓN DE SONDAS GENÉTICAS DEL DNA 3.2 TIPOS DE GRUPOS MARCADORES E INDICADORES Y SU DETECCION 3.3 PURIFICACIÓN DE SONDAS MARCADAS 3.4 FASES DE LA HIBRIDACIÓN

IES Moratalaz Biología Molecular 1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La hibridación está basada en el proceso de renaturalización de dos cadenas sencillas, procedentes de moléculas de DNA distintas. Es un proceso de construcción artificial de AN bicatenarios. El resultado pueden ser híbridos DNA-DNA, híbridos RNA-RNA O híbridos DNA-RNA. Se habla de homodúplex, cuando se hace referencia a un híbrido DNA-DNA o RNA-RNA y se denomina heterodúplex al híbrido DNA-RNA.

Nucleic Acid Hybridization DNA 5' 3' RNA 3' 5' DNA-RNA Hybridization DNA-RNA Hybrid 5' 3' 3 5* GAUČ IES Moratalaz Biología Molecular1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La hibridación en biología molecular se utiliza para detectar secuencias concretas de AN o dianas, mediante el empleo de fragmentos complementarios o sondas que se marcan para poder ser visualizados. Genéricamente, estas técnicas se conocen como técnicas de hibridación. La secuencia diana y las sondas marcadas son complementarias y detectables.

IES Moratalaz Biología Molecular 1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Hibridación positiva + +Temperatura Hibridación Sonda marcada Hibridación negativa Fig. 4.1. Esquema genérico de una técnica de hibridación con sonda, que permite detectar una secuencia de ADN específica mediante el empleo de una sonda marcada. La hibridación, la cinética de hibridación y la curva de fusión del híbrido son similares y funcionan de igual modo que la renaturalización, la cinética de renaturalización y la curva de fusión de cualquier DNA, respectivamente.

Bases Teóricas de la Hibridación

IES Moratalaz Biología Molecular1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA 2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2.3 MÉTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN 3. SONDAS DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 3.1 PREPARACIÓN DE SONDAS GENÉTICAS DEL DNA 3.2 TIPOS DE GRUPOS MARCADORES E INDICADORES Y SU DETECCIÓN 2.3 PURIFICACIÓN DE SONDAS MARCADAS 3.4 FASES DE LA HIBRIDACIÓN

Desnaturalización y Renaturalización del DNA

IES Moratalaz Biología Molecular 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA

" El proceso de hibridación se basa en los fenómenos de desnaturalización y renaturalización de AN. Los ácidos nucleicos se desnaturalizan por efecto de agentes químicos o físicos, perdiendo su conformación tridimensional, y, en especial, la naturaleza bicatenaria del DNA (doble hélice). . La desnaturalización se debe a la desestabilización, tanto de los puentes de hidrógeno entre bases como de las interacciones de apilamiento entre bases y a la pérdida del efecto hidrófobo.

Denaturation/Renaturation DNA 3ª 3! 5 DNA Denaturation GATC DNA Renaturation 5' 3 L 5' GATC IES Moratalaz Biología MolecularDesenrollamiento de las hélices : pH>13 0 Tª = 100 ℃ Desnaturalización Desnaturalización Renaturalizacion Renaturalización Dobles hélices de ADN Cadenas sencillas de ADN A la temperatura de fusión (Tm) el 50% de la doble hélice está separada.

IES Moratalaz Biología Molecular 2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA

• Agentes desnaturalizantes

Desnaturalización por efecto de la temperatura Desnaturalización por ácidos y bases Desnaturalización por agentes químicos: urea, formamida y formaldehido.

• Influencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

Hibridación de Ácidos Nucleicos

2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Ensayo de hibridación Factores que influyen en la hibridación 1. Concentración de DNA/RNA y tiempo 2. Longitud de las cadenas 3. Complementariedad y composición de bases 4. Temperatura 5. Condiciones químicas 6. Temperatura melting del hibrido

Métodos de Ensayos de Hibridación

2.3 MÉTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN IES Moratalaz Biología Molecular2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA

• Agentes desnaturalizantes

Desnaturalización por efecto de la temperatura Desnaturalización por ácidos y bases Desnaturalización por agentes químicos: urea, formamida y formaldehido.

• Influencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

IES Moratalaz Biología Molecular Agentes desnaturalizantes Desnaturalización por efecto de la temperatura

Es el agente desnaturalizante más representativo. El calentamiento gradual del DNA debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice, las dos hebras se desenrollan hasta su separación total. . Si el enfriamiento se hace lentamente, sin llegar a bajas temperaturas (hasta 20-30ºC), hay posibilidad de que las cadenas vuelvan a unirse. Si se enfría rápidamente, la renaturalización es mucho más lenta o no sucede (quedan disociadas). Esto se representa mediante la curva de fusión del ADN, ya estudiada.

Denatured DNA strands Cool to 20°℃ Nucleation event and "zipping up" Native DNA- Tm Renatured DNA- 10 50 60 70 80 90 1000 Temperature (°℃) 30 60 Time (minutes) IES Moratalaz Biología MolecularAgentes desnaturalizantes Desnaturalización por ácidos y bases

• El emparejamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad con la consiguiente desnaturalización del DNA.
• Un medio ácido puede conducir también a la ruptura de la estructura primaria de los ácidos. Por ello, para la desnaturalización del DNA, es más habitual emplear condiciones alcalinas.

IES Moratalaz Biología Molecular Agentes desnaturalizantes Desnaturalización por agentes químicos

Los agentes químicos desnaturalizantes de uso más frecuente son la urea, la formamida y el formaldehido. Son moléculas altamente polares, que compiten en la formación de enlaces de H con los grupos amino y carbonilo propios de las bases. .0 H 0 = N-C 0 H-C N-H N - H H -C `H formaldehyde formamide urea Covalent Modifier Competitive IES Moratalaz Biología MolecularInfluencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

Al aumentar la temperatura, variar el pH o aumentar la concentración del agente químico y producirse la desnaturalización, se observa una disminución en la viscosidad de la disolución de DNA. La desnaturalización del DNA va acompañada de un aumento en la A260 (a esto se le llama efecto hipercrómico). La representación gráfica de la variación de viscosidad o de A . frente a la temperatura (o concentración de agente desnaturalizante) permite obtener las curvas de desnaturalización, que son características para cada DNA en disolución (curvas de fusión o "melting"), y a la temperatura central del intervalo de transición (50% de desnaturalización) se le llama temperatura de fusión (Tm ó Tf)

1.0 F OD 260 Tm =77°C Tm = 83°C XXXXXX 0 70 75 80 85 90 95 IES Moratalaz Biología Molecular Temperature (℃) Influencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

A200 A B C 100% desnaturalización 50% desnaturalización 0% desnaturalización Temperatura (ºC) - Fig. 4.2. Curva de fusión de una molécula bicatenaria de ADN. IES Moratalaz Biología MolecularInfluencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

Estos datos son una medida de la estabilidad estructural de la molécula de ácido nucleico. Su valor depende además del pH, de la fuerza iónica del medio y de la composición en bases del ácido nucleico. Al ser más fuerte la interacción entre pares de bases C-G (3 puentes de hidrógeno) que A-T (2 puentes de hidrógeno), necesitan mayor energía para disociarse; por tanto, la Tm aumenta con el contenido en G+C del DNA, y la curva aparecerá desplazada hacia la derecha, se necesita mayor temperatura para la desnaturalización y, viceversa, cuanto más pares de A-T, mayor desplazamiento a la izquierda y menor Tm.

100- Poly (AT) 50 Naturally occurring DNA with A/T and G/C base pairs Poly (GC) - Tm 1 1 0 T 10 30 50 70 90 110 130 Temperature (℃) IES Moratalaz Biología Molecular % GC 100 - 80- 60- 40 - 20 0 70 80 90 100 110 Tm (ºC) Fig. 4.3. Gráfica que relaciona la Tm de moléculas de ADN de gran tamaño con el contenido en pares GC. Influencia de la desnaturalización sobre las propiedades del DNA

Esto permite utilizar la Tm de una muestra para estimar su composición de bases; por ejemplo, se puede utilizar para determinar la presencia de regiones ricas en G+C o de "islotes CpG" asociados frecuentemente, en el genoma eucariótico, a regiones promotoras o reguladoras de la transcripción.

Unmethylated Methylated Gene Expression CpG Island Gene Gene Expression Repressed CpG Island Gene IES Moratalaz Biología Molecular1. CONCEPTO DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN 2.1 DESNATURALIZACIÓN Y RENATURALIZACIÓN DEL DNA 2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2.3 MÉTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIÓN 3. SONDAS DE HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS 3.1 PREPARACIÓN DE SONDAS GENETICAS DEL DNA 3.2 TIPOS DE GRUPOS MARCADORES E INDICADORES Y SU DETECCIÓN 3.3 PURIFICACIÓN DE SONDAS MARCADAS 3.4 FASES DE LA HIBRIDACIÓN

IES Moratalaz Biología Molecular 2.2 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Si se parte de una mezcla desnaturalizada de moléculas distintas de DNA, pero con parte de secuencias parecidas, al renaturalizar se puede producir la asociación parcial de dos hebras procedentes de moléculas dúplex distintas. Se forman así, DNAs híbridos de doble hebra con regiones de apareamiento y de no apareamiento. Esta formación de moléculas dúplex de DNA, cuyas hebras tienen distinto origen o distinto ácido nucleico recibe el nombre de hibridación. Tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización. . También se considera hibridación a la formación de híbridos de DNA y RNA o entre un ácido nucleico y un oligonucleótido natural o sintético.

Homoduplex DNA, both strands from the same species Heteroduplex DNA; strands from different species, with some bases unpaired IES Moratalaz Biología Molecular