Tecnología del ADN recombinante: retrotranscripción, clonación y vectores

XVIII. Tecnología del ADN recombinante

-o Máster en Biología Molecular C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS- Índice

1. Retrotranscripción 4
2. Clonación 5

Clonación: Endonucleasas de restricción

2.1 Endonucleasas de restricción 5

Clonación: Vectores

2.2 Vectores 5

Clonación: Formación del ADN recombinante

2.3 Formación del ADN recombinante 6

Clonación: Transformación y transfección

2.4 Transformación y transfección 6Tecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

Objetivos

Comprender los principios de la tecnología de ADN recombinante. Entender el procedimiento de retrotranscripción Aprender los procedimientos y técnicas necesarias para la clonación de ácidos nucleicos.

Ideas clave

La tecnología del ADN recombinante consiste en construir moléculas de ADN recombinante, que contienen secuencias provenientes de más de una fuente La retrotranscripción consiste en realizar una copia de ADN a partir de un molde de ARN. La clonación de ácidos nucleicos consiste en la introducción de ADN de un organismo en el genoma de otro y su multiplicación. Las endonucleasas de restricción cortan el ADN no metilado en secuencias específicas. Los vectores más empleados son los plásmidos, los bacteriófagos, los cósmidos y los vectores de expresión.

Introducción

La tecnología del ADN recombinante consiste en construir moléculas de ADN recombinante, que contienen secuencias provenientes de más de una fuente. Para esto, es necesario en aislar fragmentos de ADN de un organismo e introducirlos en el genoma de otro organismo. Normalmente, el vector en el que se introduce el fragmento de ADN es capaz de replicarse selectivamente, lo que permite amplificar el número de copias de dicho fragmento. Al procedimiento de introducción de un fragmento de ADN en un vector y su multiplicación, se le denomina clonación. El proceso de clonación se puede realizar de diferentes formas, pero todas comienzan con un fragmento aislado de ADN. Para obtener este ADN, se puede aislar directamente de un organismo o puede sintetizarse un ADN copia (ADNc) a partir de un ARNm. 3 0C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

1. Retrotranscripción

Para obtener una copia en ADN de una molécula de ARN (ADN copia o ADNc) se emplea una transcritasa inversa, en un proceso denominado retrotranscripción. El procedimiento comienza con el aislamiento de ARN (generalmente ARNm) de las células. A continuación, la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa sintetiza una hebra de ADN complementaria al ARNm, utilizando como cebadores específicos u oligodT. Después, se elimina la hebra de ARNm, quedando una ADNc de cadena sencilla. Por último, una DNA polimerasa sintetiza la otra hebra del ADNc. 4 ọTecnologías de análisis y manipulación de ácidos nucleicos

2. Clonación

El proceso de clonación comienza con un fragmento purificado de ADN. A continuación se corta con endonucleasas de restricción y se introduce en un vector. Posteriormente, ese vector se introduce en una célula donde se van a realizar múltiples copias.

2.1 Endonucleasas de restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas que rompen los enlaces fosfodiéster en secuencias palindrómicas específicas del ADN (dianas de restricción), que constan de 4 a 6 nucleótidos. Pueden dar lugar a extremos romos (si cortan las dos hebras del ADN a la misma altura) o extremos cohesivos (si cortan cada hebra en un lugar diferente). Las endonucleasas de restricción se aíslan de bacterias donde actúan como un mecanismo de defensa, degradando el material genético extraño, generalmente vírico, que entra en la célula. Las bacterias metilan su ADN en las dianas de restricción, lo que les sirve para distinguir entre el propio y el ajeno, ya que las enzimas de restricción no pueden cortar ADN metilado. Existen 3 tipos principales de enzimas de restricción:

• Endonucleasas de restricción de tipo I: Tiene actividad de restricción y metilación. Al reconocer la diana de restricción, corta al azar en sitios distintos al sitio de reconoci- miento, ya sea más arriba o más abajo, dando lugar a extremos cohesivos. Necesitan como cofactores magnesio, SAM, además de ATP.
• Endonucleasas de restricción de tipo II: Solo tienen actividad de restricción. Cortan la secuencia de ADN en el sitio de reconocimiento. Emplean magnesio como cofactor.
• Endonucleasas de restricción de tipo III: Tienen función de restricción y metilación. Cortan a 25-27 bp de la diana de restricción, dejando extremos cohesivos. Necesitan ATP, magnesio y SAM como cofactores.

En la tecnología del ADN recombinante se emplean fundamentalmente las endonucleasas de restricción de tipo II. Las enzimas de restricción más utilizadas son EcoRI, BamHI, HindIII, EcoRV y NotI.

2.2 Vectores

Los vectores son moléculas pequeñas, bien caracterizadas, que presentan un origen de replicación que le permite su propia multiplicación y la de su inserto. Además, es necesario que sea fácil su recuperación y purificación. Los vectores más empleados son los plásmidos, los bacteriófagos (principalmente, el fago lambda y el fago M13), los cósmidos y los vectores de expresión. 5C CENTRO EUROPEO DE MASTERS Y POSTGRADOS O

Los plásmidos son pequeñas moléculas de ADN circular, capaces de replicarse de forma autónoma en las células. Se introducen en las bacterias mediante transformación, ya que las bacterias como E. coli se hacen permeables al ADN al ser tratadas con cloruro cálcico. Su principal ventaja es que muchos de ellos portan genes de resistencia a antibióticos, lo que permite la selección directa de las bacterias que lo portan. Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan a bacterias. Los fagos más empleados en clonación son el fago lambda y el fago M13. El fago lambda es adecuado para clonar fragmentos de ADN de 15-20 kb. Se emplean estirpes de fago lambda a los que se les elimina la parte de su propio ADN innecesaria para la replicación. Por otro lado, el fago M13 incorpora insertos de cadena sencilla. Los cósmidos son híbridos del fago lambda y plasmidos. Permiten la clonación de insertos de hasta 45 kb. Se generan por la introducción en un plásmido de trozos especiales del fago lambda llamados sitios cos. Estos sitios cos (cohesive sites) son reconocidos por la maquinaria de empaquetamiento del fago. Los cósmidos se mantienen in vivo como plásmidos, pero permiten la purificación por empaquetamiento in vitro. Los vectores de expresión, como su nombre indica, permiten la expresión de las secuencias clonadas, al fusionar dichas secuencias con un sitio de inicio de la transcripción y un sitio de inicio de la traducción.

2.3 Formación del ADN recombinante

Los fragmentos de ADN, bien purificado directamente de un organismo o bien ADNc, se introducen en el vector. Tanto el vector como el fragmento de ADN se cortan con la misma enzima de restricción, que genera extremos cohesivos. Los extremos de ambas moléculas se unen gracias a la acción de una ligasa.

2.4 Transformación y transfección

Una vez unidos el vector y el ADN de interés, se introducen en la célula hospedadora, mediante transformación (bacterias) o transfección (células eucariotas). En el caso de que se introduzca el ADN en una célula hospedadora mediante un virus, se denomina transducción.

2.4.1 Métodos de transfección

La primera distinción que se puede hacer es entre transfección estable y transitoria. En la transfección estable los genes introducidos habitualmente se integran en el genoma de la célula hospedadora y se expresan constitutivamente o de forma inducida. En la transfección transitoria, no se integran en el genoma celular y se expresan durante un periodo de tiempo. Existen distintos métodos que permiten introducir ADN exógeno en el interior de una célula eucariota:

• Electroporación: mediante descargas eléctricas se forman poros en la membrana.
• 7 Fosfato cálcico: se mezcla con el ADN, formándose un precipitado que las células captan.
• 7 Liposomas: vesículas esféricas con una membrana compuesta de una doble capa de fosfolípidos, que constan de partes hidrosolubles y liposolubles.

Polímeros catiónicos: el ADN se une al polímero y el complejo es endocitado por la célula.

2.4.2 Transformación bacteriana

El término transformación para denominar al proceso de introducción e incorporación de ADN en las bacterias lo acuñaron Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty, en 1944. Para que las bacterias puedan captar el vector tienen que estar en estado de competencia. Es decir, su membrana se hace más permeable, de manera que puede entrar el ADN exógeno. El estado de competencia puede producirse de forma natural o inducirse. La forma más sencilla para producir células competentes es mediante shock térmico en presencia de iones divalentes (Cl2Ca). En primer lugar se enfrían las bacterias en hielo durante unos minutos, a continuación se meten a 42ºC durante 50 segundos y, luego, se vuelven a enfriar. Este proceso permite al ADN entrar en las células. Otro sistema para la transformación bacteriana es la electroporación. 7