Herramientas moleculares para la identificacion de microorganismos, Universidad de Chile

Ingeniería Química, Biotecnología y Materiales

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS UNIVERSIDAD DE CHILE

Herramientas Moleculares para la Identificación de Microorganismos

Bt4114 Oriana Salazar 8 mayo 2025

Consorcios Microbianos en Procesos Biotecnológicos

Un consorcio o comunidad microbiana está formado por dos o más grupos de microbios que viven en simbiosis .

Microbial Consortia

Ejectsapk A -. + Waste water Sources Electricity Microbial Fuel Cell (MFC)

Aplicaciones Industriales

• Electronic instruments
• Laboratories

Biolixiviación Tratamiento de aguas servidas Organic Waste Thermal Energy Electrical Energy Biogas Anaerobic Digestion Fuel LNC Producción de biogas Acid production 2H+ SO42- Sulphide mineral S oxidizing bacteria 02 Fe3+ Fe2+ Sº Fe2+ M2 + Metal released / leached Fe oxidizing bacteria Producción de vino

Características de los Consorcios Microbianos

• Comunicación entre miembros
• División del trabajo, especialización, cooperatividad
• Permite:
• Reciclaje de nutrientes
• Eficiencia en uso de los recursos
• Optimización de multiples labores simultáneas en la comunidad
• Productividad aumentada

Importancia de la Identificación de Microorganismos en Comunidades: El Caso de la Producción de Quesos

Leche Queso FERMENTACION Bacterias lácticas Lactosa Ac. láctico CHEOH 0 CHE OH H O OH H OH H CH H3C H OH OH H H Disminuye el pH Precipita la caseína # Microbiota láctica, # cualidades organolépticas del queso

Microbiota Láctica

Aerococcus Carnobacterium Lactococcus Oenococcus Pediococcus Tetragenococcus Vagococcus Weissella Streptococons

• Aisladas alimentos fermentados y tracto intestinal
• bacterias gram-positivas
• bacilos o cocos que forman pares, tétradas o cadenas
• producen principalmente ácido láctico como producto de la fermentación de carbohidratos

La microbiota NATIVA coloniza naturalmente la leche y está asociada a las condiciones de producción

¿De qué Serviría el Análisis de la Microbiota del Queso?

Identificar la microbiota láctica dominante Caracterizar la microbiota láctica según zona geográfica de producción Caracterizar la microbiota láctica según tiempo de maduración

Lactobacillus Leuconostoc Enterococcus OH HU.C. OH

Métodos Tradicionales para Analizar Comunidades Microbianas

1. Aislamiento, recuento y estudio morfo-fisiológico

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9-ml broth Sample to be counted 1/10 1/100 1/102 1/103 1/104 1/105 1/106 Plate 1-ml samples 159 17 2 0 Too many to count 159 x 103 Plate Dilution count factor 1.59 x 105 Organisms per ml of original sample

• Técnica laboriosa
• bacterias demoran en crecer
• se necesita conocer a priori las bacterias presentes para utilizar los medios de cultivo adecuados

Diferentes morfologías de colonias bacterianas

TSA >Ps. poae S. proteamaculans SP. połymyxa B. thuringiensis >C. indologenes Ps. jessenii Ps. mediterranea Ps. synxantha >B. megaterium >B. weihenstephanensis >Str. scabrisporus >Ste. maltophilia J. lividum PB. simplex K. trevisanii B. subtilis Ac. haemolyticus Ps. mosselii SC Ac. rhizosphaerae >Mi. carbonacea Str. drozdowiczit DR. corynebacterioides Str. ciscaucasicus >Str. virginiae >Str. carpaticus Str. flavovirens >Str. xanthophaeus Str. griseoaurantiacus M. oxydans Bu. phytofirmans YEPD Ps. putida Sta. epidermidis B. cereus Str. violaceorubidus Ps. filiscindens Ps. fluorecens Pa. agglomerans AZO Ar. dextranohyticus Ar. nicotinovorans >Ps. cedrella

Métodos Tradicionales para Analizar Comunidades Microbianas

2. Batería de pruebas bioquímicas

• Son pruebas que consisten en distintos test químicos o bioquímicos aplicados microorganismos para los cuales la reacción es conocida.
• Nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
• Por ejemplo, la producción rápida y sostenida de burbujas o el cambio de color del medio constituyen reacciones positivas.
• Requieren crecimiento microbiano

Medios diferenciales

LIA Telmeds.org Nedio de SON UREA Telmeds.org Medio con TSI Teleds.org Madio con cfrito

Desventajas de los Métodos Tradicionales Dependientes de Cultivo

• Una gran proporción de bacterias no puede ser cultivada
• Por ejemplo, sólo el 20 a 30% de las bacterias del ecosistema digestivo humano pueden ser cultivadas.
• Menos del 1% de las bacterias de ambientes acuáticos pueden ser cultivadas
• ¿ Por qué?
• Tienen requerimientos nutricionales especiales o requerimientos de sustancias producidas por otras bacterias de la comunidad
• Para cultivar todas las bacterias a la vez, se necesitarían muchos medios de cultivo y condiciones

Uso de Técnicas Moleculares para Identificación

• Utilizando las herramientas moleculares en sistemas microbianos podemos encontrar la respuesta a las preguntas como
• ¿ Qué especies existen en el ambiente?
• ¿ Qué hacen estas especies ahí?
• ¿ Cuántos microorganismos hay?,
• ¿ Qué especies están utilizando los compuestos del medio?

G 4 A

Métodos Moleculares de Identificación Bacteriana

Análisis parcial de comunidades

• Técnicas de fingerprinting (ARDRA, T-RFLP, DGGE)
• Q- PCR (real-time PCR)
• FISH, hibridización dot-blot.
• Análisis de lípidos microbianos

Análisis de comunidades completas

• Secuenciación masiva
• Todas las OMICAs (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica).

Filogenia

• Filogenia: representación de los lazos evolutivos entre los grupos de organismos
• Los resultados se representan en un árbol filogenético que muestra visualmente los lazos basados en características físicas y genéticas compartidas o divergentes

A B D) E F (G Fruta camoso Semilla rugosa C Tallo leñoso Pétalos rojos Petalos blancos, tallo herbaceo, hojas sin tricomas, 5 estambres, fruto seco, semilla lisa

• La filogenética molecular es la rama de la filogenia que analiza las diferencias moleculares hereditarias en las secuencias de ADN, ARN y proteínas.
• Se obtiene información sobre las relaciones evolutivas de un organismo. El resultado se expresa en un árbol filogenético

Protozoan eukaryote 2 BOT ER Protozoan eukaryote 3 LO BAT CHICK HANSY Protozoan eukaryote 4 DROHE Bacteria 6 DICDI FEARS MAKI BULAC Bacteria 5 HERLALA PTRAI HHLAIGEERTVET HETAC Bacteria 4 HETHA MADREERTERD ABCES HAYS AKGOFFERTE KVALWERBE Protozoan eukaryote 1 HETTE HITAESI HIDAKSE HETVA HETJA -HETE FYRAB Bacteria 1 PTERO FTEFE HARVAE HALMA MEREBERKTETEREN HALYO HALSA MUALEGETTEEV LYDELE THE AC -NEEVOQUE THEVO Bacteria 3 PICTO NTEPROWEIDEN HETKA Bacteria 2 BRAKE

Gen ARNr 16S

Ribosome 7 30S subunit 16S ribosomal RNA 50S subunit 16S 23S 5S Bacterial genome 16S IRNA gene 23S IRNA gre 5S IRNA gene V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 base 27F 341F 530F 685R 907R 1100R 1392R 1492R

Características del Gen ARNr 16S

Target Direction Primer Pair Nucleotide Sequence 5' ->3' Reference Forward BF27 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG [14] Reverse BR1462 TCCAGCCGCAGATTCCCCTAC Forward BF27 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG [14] Bacteria Reverse B765R CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC [15] Forward B704F GTAGCGGTGAAATGCGTAGA [15] Archaea Reverse BR1462 TCCAGCCGCAGATTCCCCTAC [14] Forward B22F ATTCCGGTTGATCCTGC Bacteria Reverse B1521R AGGAGGTGATCCAGCCGCAG Forward BF8 TTGATCCTGCCGGAGGC- CATTG [14] [ Reverse BR1462 TCCAGCCGCAGATTCCCCTAC Archaea

• Gen relativamente corto ~ 1500.
• 10 regiones conservadas entre bacterias.
• 9 regiones altamente variables.

[15] Archaea

¿Por qué el rRNA 16S es Considerado un Marcador Filogenético?

• Participa en traducción de proteínas. Por lo tanto, es universal
• No se transfiere horizontalmente
• Largo conveniente: 1500 bp
• Presenta regiones altamente conservadas y otras especie- específicas.
• Disponibles grandes bases de datos con secuencias de rDNA.

Otros marcadores filogenéticos

• Proteínas: sin embargo, difícil identificar proteínas homólogas en m.o. distintos
• Históricamente, también se han usado 5S rRNA, 23S rRNA, región espaciadora intergénica entre 16S - 23s
• 18S en eucariontes (ITS)

ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

16S rDNA PCR amplification - 16S rDNA 16S rDNA Microbial community Genomic DNA Digestion with restriction enzymes - Agarose gel electrophoresis Analysis of digestion pattern

Ejemplos de ARDRA

Patrones 16S-ARDRA para muestras de especies estándar de lactobacillus. Producto de PCR 16S cortado con AluI M 1 2 34 56 789 1500 1. L. sakei 2. L. casei 1000 3. L. acidophilus 4. L. delbrueckii 5. L. brevis 500 400 300 200 100 A IN IN DID1-D2 D2 an ox an ox ox an ARDRA de lodos activados. Diferentes niveles de oxigenación y temperaturas en el reactor generan cambios en las comunidades microbianas. DOI: 10.12691/ijebb-2-4- 7 6. L. plantarum 7. L. curvatus 8. L. fermentum 9. L. lindneri

Ventajas, Desventajas y Usos de ARDRA

• Técnica es rápida, fácil y de bajo costo.
• La complejidad de los perfiles de bandas es la principal limitación. Por lo tanto, se utiliza en poblaciones con pocas especies bacterianas.
• . Aunque es difícil asignar identidad a los m.o. presentes en la comunidad, se puede utilizar para evaluar cambios en la diversidad microbiana en respuesta a condiciones ambientales cambiantes.
• Debido a la complejidad, se requieren múltiples endonucleasas de restricción, por separado o en combinación, para obtener la resolución deseada.
• La técnica muestra un bajo poder discriminatorio debido a la naturaleza comparativamente conservada de los genes 16S rRNA.
• Sensibilidad del método está limitada por la sensibilidad de métodos de tinción de DNA en gel.

T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

Microbial sample from polluted site SI Total DNA isolation PCR amplification and fluorescent primer addition Relative fluorescence intensity Electrophoresis - h a Electropherogram Retention time/fragment length + Electroforetograma 30,0 mAU signal = 350 nm 27,5 reference = 230 nm 25,0 1 1 22.5 2 20.0 17,5 15,0 12,5 10,0 7.5 5.0 2.5 - 0 -2,5 min -5,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0 24,0 Electroforesis capilar Migración de fragmentos de ADN Detector de fluorescencia Láser Muestra/ Buffer Buffer Restriction digestion a b c d . e f € b h d + Fuente: Wikimedia Commons 3T-RF length in nucleotides X1-4 aluSample9 + q 50 100 150 200 250 300 350 400 450 . 3000 'elative peak height 2400° 1800 1200 600 " 1 . 0 BGYRX: Y: Dye/Sample Peak Minutes Size Peak Height Peak Area Data Point D, ZT 14.04 197.01 159 1490 4045 B, 22 14.88 199.49 374 3975 4058 B, 23 15.16 209.40 200 1887 4133 B, 24 15.28 213.68 899 9612 4165 B, 25 15.34 215.95 872 8893 4182 B, 26 15.40 218.24 147 1247 4199 B, 27 15.96 238.94 159 2059 4351 B, 28 17.84 313.71 164 2212 4865 B, 29 18.27 331.73 154 1109 4983 B, 30 18.30 332.62 173 1531 4989 B, 31 18.40 336.92 92 439 5018 B, 32 20.60 425.59 100 1291 5618 B, 33 25.11 101 363 6847 G. 1 10.07 34.74 100 698 2746 G. 2 10.23 40.47 160 1380 2789 G. 3 10.73 56.45 113 625 2924 G. 4 11.12 68.17 215 1360 3033 G. 5 11.16 69.14 2135 10987 3042 G. 6 11.35 74.79 162 893 3095 G, 7 12.18 102.85 1 40 885 3320 G. 8 12.48 112.89 485 6849 3403 G. 9 12.54 114.98 129 574 3420 G, 10 12.88 126.35 882 5354 3511 G, 11 12.91 127.49 3574 21516 3520 G. 12 12.94 128.51 2086 11266 3528 / Electropherogram: a visual profile of the community. In principle, the height and area of the peaks are representative of the abundance of the groups of organisms. Several groups of organisms may share the same T-RF. Table: digital data can be further processed and used, for example, to generate dendrograms illustrating the relationship between bacterial communities.