Los Métodos de Clonación Molecular: Componentes y Técnicas de Selección

Necesidad de disponer de una cantidad apreciable de ácidos nucleicos

para poder realizar análisis tanto a nivel estructural como a nivel funcional. Es habitual un primer paso de amplificación mediante: -PCR -Clonación molecular La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o ADNc basada en la Tecnología del ADN recombinante. La tecnología del ADN recombinante es una aplicación importante de las endonucleasas de restricción en biologia molecular que permet crear moléculas de ADN recombinante que entrará en una célula huésped. Por multiplicación de estas células huésped en cultivo se consiguen multitud de copias de ADN recombinante y, en consecuencia, del fragmento de interés.

Proceso de clonación molecular

1. Inserción del fragmento de ADN que se desea amplificar en una molécula portadora o vector.
2. Introducción del vector recombinante en la cel·lula viva hoste.
3. Selección y multiplicación en cultivo de las células que llevan el ADN recombinante.
4. Recuperación del fragmento amplificado.

Aunque es una técnica manual y que requiere dedicar varios días a su realización, ofrece importantes ventajas:

1. Permite obtener prácticamente cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
2. Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño, mucho mayores que las que se pueden amplificar por PCR (incluso millones de pb), dependiendo del vector utilizado.
3. En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo, fragmentándolo previamente + permite la creación de librerías genómicas.
4. También se pueden clonar simultáneamente todos los ARNm de una población celular en forma de ADNc, permitiendo la creación de librerías de ADNc.
5. Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés con diversas aplicaciones: +Industriales para la producción de proteínas, hormonas, etc. +Investigación +Agricultura (OGM) +Medicina (terapia génica)

Componentes de la clonación

Los componentes principales que intervienen en el proceso de clonación molecular son: ·Vectores de clonación ·Cèl·lules hoste

Vectores de clonación

Son moléculas de ADN que pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped y que permiten la inserción deADN extraño, sin perder esta capacidad de replicación autónoma. +Pueden actuar como auténticos vehículos de clonación, transportando los fragmentos de ADN que se quieren clonar en el interior de células huésped, donde se replicarán. 2+El fragmento de ADN de interés que se introduce en el vector recibe el nombre deinsertar.

Características de los vectores de clonación

Para poder ser utilizada como vector, una molécula de ADN debe reunir varias características: +Tenir y origen de replicación que le permita replicarse en la célula huésped junto al fragmento de ADN extraño que transporta. +Tener, como mínimo, un Isitio de inserción de ADN extraño. Normalmente son secuencias diana de enzimas de restricción, presentes una sola vez en toda la molécula. · Los vectores de última generación suelen tener múltiples dianas de restricción diferentes y únicas, para posibilitar la inserción de prácticamente cualquier ADN extraño. · Incluso, en algunos vectores, todas las dianas de restricción se concentran en un segmento corto del vector + sitio múltiplo de restricción o lugar múltiplo de clonación (polylinker) + Contener alguno marcador de selección, que permita distinguir las células que llevan el vector de aquellas que no lo llevan. . Normalmente son genes de resistencia a antibióticos o genes que codifican enzimas que no tiene de forma natural la célula huésped. + Contiene un marcador de identificación, que permita distinguir las células que llevan el vector recombinante, con ADN extraño, de aquellas que llevan un vector sin ADN extraño. (GFP: Proteína verde fluorescente procedente de la medusa). + Algunos vectores también contienen un promotor, que posibilita la transcripción del inserto y su posterior traducción a proteína + vectores de expresión.

Tipo de vectores

Hay varios tipos de vectores que se diferencian por: 3· El origen de la molécula · La disposición de los diferentes elementos que lo integran · El tamaño de los fragmentos de ADN extraño que pueden incorporarse. Entre los más utilizados encontramos: · Plasmidios · Maricones · Cósmidos · Fagémidos · Cromosomas artificiales

Plasmidios

Son Moléculas circulares extracromosomicas de ADN bicatenario de origen bacteriano. con capacidad autónoma de replicación. Partiendo de plasmidos naturales, se han diseñado multitud de vectores plasmídicos, modificándolos mediante ingeniería genéticoa para mejorar sus prestaciones como vectores de clonación. Para cada paso particular de clonación, a la hora de escoger el plásmido idóneo intervienen dos parámetros importantes: +La tamaño de inserción que poden transportar +El número de copias del plasmido por célula al que puede llegar después de su replicación en la célula huésped. Algunos de los plásmidos más utilizados son el pBR322 i el pUC18: + pBR322: puede transportar fragmentos de ADN relativamente pequeños (3,5-5kb) y el número de copias por célula es de alrededor de 20. + pUC18: muy utilizado por su capacidad para aceptar insertos de hasta 10kb y su alta tasa de replicación, en torno a 500 copias por célula.

Bacteriófagos

Fagos, son virus que infectan bacterias. 4Una vez el virus introduce su material genético en el interior de la bacteria, se apodera de la maquinaria metabólica de la célula infectada y desarrolla un ciclo lítico: · Replicación del cromosoma vírico · Síntesis de proteínas víricas · Empaquetamiento de nuevos virus · Liberación de los virus en el medio previa lisis celular Algunos fagos pueden, alternativamente, insertar temporalmente su material genético en el cromosoma bacteriano mediante recombinación - ciclo lisogénico. · Ex. sujeto lambda, uno de los más utilizados como vector de clonación. Estos vectores pueden incluir insertos de hasta 20Kb.

Bacteriófago M13

Su material genético es ADN monocatenario, pero cuando infecta una bacteria se replica dando lugar a una molécula circular bicateneria llamada forma replicativa (RF). len RF se puede utilizar como vector de clonación, insertando fragmentos de ADN extraño. Cuando las RF recombinantes se introducen en una célula huésped, se replican autonomamente originando cadenas simples (con el inserto) que se empaquetan en viriones y se expulsan fuera de la célula (sin lisis celular). Estas cadenas simples amplificadas son muy útiles por secuenciación.

Cósmidos

Son vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del sujeto 2 y parte de uno plásmido bacteriano. Contienen: ·Seqüències cos del fag 2 ·Origen de replicación de un plásmido ·Gen de resistencia a antibióticos ·Polienlazador La presencia de secuencias cuerpo permite empaquetar estos vectores en cápsidas del fago 2. Este tipo de vectores admite insertos de mayor tamaño, hasta 50 kb. 5

Fagémidos

Son vectores híbridos formados por un plásmidoy (con su origen de replicación bacteriano), al que se le inserta el origen de replicación de unon sujeto M13. Cuando se introducen en una célula huésped se comportan como cualquier otro vector plasmídico, pero tienen la posibilidad de producir ADN monocatenario. Se infecta la célula huésped con M13, por lo que las proteínas del virus reconocen el origen de replicación del fagemido e inician la replicación de cadenas sencillas que aparecen en el medio externo. Este tipo de vectores son útiles para experimentos de secuenciación y producir sondas monocatenarias.

Cromosomas artificiales

Son vectores de clonación con capacidad de transportar fragmentos de gran tamaño. Son Vectores de alta capacidad, idóneos para la construcción de genoques genómicas, ya que permiten clonar fragmentos de ADN de gran tamaño con gran estabilidad. Los más utilizados son los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y los cromosomas artificial de levaduras (YAC).

Cromosomas artificiales bacterianos (BAC)

Pueden transportar insertos de ADN extraño de hasta 300kb.

Cromosomas artificiales de levados (YAC)

Cromosoma artificial de levadura: son los vectores de mayor capacidad, pueden transportar insertos de >1Mb

Vectores lanzadera

6EL vectors transbordador, son un tipo de vector híbrido que contienen orígenes de replicación de dos huéspedes distintos, normalmente uno de un plásmido bacteriano y otro de levadura o de virus animal, como el SV40. Se construyen con marcadores genéticos que permiten su selección en ambos sistemas huésped. Se utilizan para transportar insertos entre dos huéspedes diferentes, habitualmente por estudios de expresión génica: · En el cebador, normalmente E. Coli, el inserto está amplificado. · En el segundo se expresa el gen amplificado.

Células huésped

Son las células en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación. La célula con el vector se cultiva en medios adecuados en los que se multiplica + células hijas, todas con la misma carga genetica: Clones. La elección de la célula huésped depende del vector de clonación utilizado y de la finalidad buscada + en muchos casos se habla de sistema vector/huésped. Los huéspedes pueden ser células eucariotas o procariotas (bacterias).

Células hoste bacterianas

Son las más utilizadas como huéspedes para clonar plásmidos, fagos y cósmidos: +Escasa complicación técnica de su manipulación +Gran versatilidad +Velocidad de crecimiento Se suelen utilizar cepas defectivas especiales a las que les falta alguna actividad enzimática para favorecer la estabilidad del vector. +Por ejemplo, exonucleasas sensoriales para evitar la degradación de vectores de clonación lineales. +Gen sentidoEs que controlan la recombinación génica, para evitar la integración del vector en el cromosoma bacteriano. 7La bacteria más utilizada en clonación es E. coli, en términos concretos soca K12, pero se pueden utilizar otras especies como Bacillus subtilis y especies del género Streptomyces.

Células hoste eucariotas - levadura

Levaduras: · Organismos unicelulares que crecen de forma similar a bacterias en medios de cultivo sólidos y líquidos. · Se utilizan como huéspedes para clonar YAC y plásmidos de levaduras basadas en el plasmido 2u. La levadura más utilizada en clonación es Santa Cerveza, aunque se pueden utilizar otras especies como Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.

Células vegetales y animales

EL células vegetales y animales en cultivo, también pueden ser utilizadas como huésped de determinados vectores de clonación. Se utilizan principalmente en experimentos de clonación encaminados a la inserción de genes extraños en el genoma de la célula huésped y su posterior expresión por obtenerr organismos transgénicos. En el cas de les células vegetales, se acostumbran a utilizar vectores basados en el plásmidos ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens.

Plasmidios tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que infecta muchas especies de plantas, produciendo la aparición de tumores o agallas. Las cepas patogénicas se caracterizan por tener un plásmido conjugativo de gran tamaño, llamado Plásmidos Ti. Durante el proceso de infección, las bacterias transfieren el plásmido Ti a la célula vegetal y una parte de él, ADN-T, s'integra al ADN cromosómico de la célula y se expresa. 8