Técnicas de Cuantificación de Microorganismos, Presentación

06/04/2025

TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Introducción y Crecimiento Poblacional

1. Introducción. Crecimiento poblacional
2. Métodos de cuantificación de microorganismos

Métodos Directos de Cuantificación

1. Métodos directos

   1. Métodos directos para biomasa.

   2. Métodos directos de número o recuento. Cámaras de

      recuento. Contadores de partículas. Citometría de flujo.

Métodos Indirectos de Cuantificación

1. Métodos indirectos

   1. Recuento en placa
   2. Filtración por membrana
   3. Número más probable (NMP)

   4. Medida de actividades metabólicas, microcalorimetría,

      medida de algún componente celular.

   5. Turbidez. Espectrofotómetro. Escala de McFarland.

Introducción al Crecimiento

1. Introducción

CRECIMIENTO: incremento ordenado de todos los componentes

de un sistema.

• en organismos pluricelulares: >aumento del tamaño del

individuo

• en organismos unicelulares (fisión binaria ó gemación): >

  aumento de la población

Crecimiento Bacteriano y Ciclo Celular

Crecimiento bacteriano

DNIA

replication

Cel

elongation

Septum formation

One generation

Completion of

septum with

formation of

distinct walls

Cell separation

Ciclo celular: secuencia completa de

eventos entre la formación de una célula

y la siguiente división

Crecimiento Individual y Poblacional

Crecimiento individual

Es el incremento en el tamaño y peso y es

usualmente un preludio a la división

celular. La mayoría de los procariotas se

dividen por fisión binaria

Crecimiento poblacional

Es el incremento en el número de células

como consecuencia del crecimiento y la

división celular.

Medición del Crecimiento Poblacional Bacteriano

106/04/2025

El crecimiento de poblaciones bacterianas (crecimiento

poblacional) se mide:

1. - Estimando los cambios en el número (recuento) de células

   (células/ml, células/g, UFC/ml)

2. - Cambios en la cantidad de algún componente de las mismas

   (proteínas, ADN, nitrógeno, clorofilas ........ ) o incluso

3. - Cambios en la propia masa de las células (biomasa: g/ml,

   mg/ml, µg/ml)

Métodos de Determinación y Tipos de Medidas

Estas determinaciones pueden llevarse a cabo mediante

• Métodos directos

• Métodos indirectos > Requieren gráficas o tablas de

  referencia que relacionen la medida concreta con la masa o el

  número de células obtenidos mediante un método directo

Estos métodos considerarán medidas de TOTALES (todas las

células) o medidas de VIABLES, sólo aquellas células que son capaces

de dividirse y formar descendencia

Métodos Directos

Métodos Directos para Biomasa

2.1. Métodos directos

2.1.1. Métodos directos para biomasa

Determinación peso húmedo (totales)

• centrifugación de un volumen determinado de cultivo
• eliminar el sobrenadante
• pesar el sedimento
• ventajas e inconvenientes: útil para grandes volúmenes de

muestra. Agua intercelular retenida

...

Determinación de Peso Seco

> Determinación peso seco (totales)

• centrifugación/filtración de un volumen determinado de

cultivo

• eliminar el sobrenadante (si es por centrifugación)
• secar el sedimento o el filtro (110℃)
• enfriar en cámara de desecación
• pesar (10-15% del peso húmedo)
• ventajas e inconvenientes: se incluye todo, vivo y muerto.

Métodos Directos de Recuento

206/04/2025

2.1.2. Métodos directos de número o recuento

• Recuento microscópico en cámara de recuento (totales y

  viables, mediante el uso de determinados colorantes)

• Contador electrónico tipo Coulter (totales)

• Citometría de flujo (totales y viables mediante el uso de

  determinadas sustancias como el yoduro de propidio, PI)

Cámaras de Recuento

Cámaras de recuento

Las cámaras de recuento se utilizan para contar visualmente con

un microscopio el número de partículas por unidad de volumen

de una muestra líquida.

Se trata por tanto de un método de RECUENTO DIRECTO DE

TOTALES, útil para recuento de leucocitos, eritrocitos,

trombocitos, bacterias, levaduras, esporas, polen etc y de

VIABLES, si se utilizan colorantes específicos.

Es una práctica de rutina en hospitales y laboratorios de

investigación.

Tipos de Cámaras de Recuento

Cámaras de recuento

Hay distintos tipos de cámaras de recuento-> Petroff-Hausser,

Neubauer, Bürker, Fuchs-Rosenthal, Thoma ...

• Todas consisten en una placa base en vidrio óptico especial con

  una serie de ranuras grabadas en la superficie y una o dos

  retículas de recuento con medidas muy concretas

1 mm

W

W

1 mm

IR

B

R

R

W

N

side view

cover slip

0.1 mm

moat

moal

*

En la rejilla cabe un volumen determinado de la muestra que se desea

medir. Esa zona se cubre con un portaobjetos y el conteo se hace con

un microscopio de campo claro o de contraste de fases.

Cámara de Petroff-Hausser

306/04/2025

Cámara de Petroff-Hausser

Zona de recuento:

1 cuadro grande dividido en 25 cuadros medianos

1 cuadro mediano en 16 pequeños

Lado de la rejilla (1 cuadro grande): 1mm

Superficie de la rejilla: 1 mm2

Profundidad: 0,02 mm

Volumen total de la rejilla: 0,02 mm3

Bordes que sostienen el cubreobjetos

Imagen de"Brock Biologia de los Microorganismos". 10ª

ed., Madigan, Martinko y Parker (Prentice Hall)

Nº de células / ml de muestra.

0989

• N (nº de células en la rejilla): contar 10 cuadros

  medianos, hacer la media y multiplicar por 25.

C

N

1000 mm

X

X factor de dilución utilizado (f.d.)

0,02 mm

3

1 ml

Cámara de Neubauer Improved

Cámara de Neubauer improved (mejorada)

1mm

W

N

Imm

R

R

W

N

side view

cover sip

0.1 mm

moat

moat

Rejilla con 9 cuadros grandes.

Lado de cada cuadro grande: 1mm

Lado de la rejilla: 3 mm

Profundidad: 0,1mm

Volumen de 1 cuadro grande: 0,1 mm3

Zonas de recuento:

• 4 cuadros grandes en las esquinas, para contar células de gran

  tamaño como leucocitos. Cada uno dividido en 16 o 25 cuadros

  medianos (según modelo)

• 1 cuadro grande central, para contar células de pequeño tamaño

  como eritrocitos o trombocitos. Dividido en 25 cuadros medianos.

  Cada cuadro mediano en 16 pequeños.

Cálculo en Cámara de Neubauer

406/04/2025

Cámara de Neubauer

.

.

.

.

N : media del nº de células de los

4 cuadros grandes de las esquinas.

N : media de contar 5 cuadros medianos

separados (en diagonal o 4 esquinas y

central) X 25.

1000 mm3

X

X f.d.

N

1000 mm3

0,1 mm

3

1 ml

X

X f.d.

0,1 mm

3

1 ml

Ventajas e Inconvenientes de Cámaras de Recuento

PRÁCTICAS iii

Cámaras de recuento. Ventajas e Inconvenientes

>MÉTODO RÁPIDO, FÁCIL, relativamente BARATO

>CÉLULAS PEQUEÑAS-> DIFÍCILES DE VER

>CÉLULAS MÓVILES-> Necesario INMOVILIZARLAS

>ERRORES VISUALES

>NO ADECUADO PARA BAJAS DENSIDADES CELULARES

Contador Electrónico y Citometría de Flujo

Contador electrónico tipo Coulter

Se hace pasar una suspensión bacteriana a través de un capilar o un

poro que forma parte de un circuito eléctrico. El paso de cada

partícula altera la conductividad y queda registrado en un contador.

TOTALES

Citómetro de Flujo

Se hace pasar una suspensión bacteriana delante de un haz de láser

focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce

señales que se traducen en señales electrónicas que son digitalizadas.

TOTALES y VIABLES si se utilizan adecuadas sustancias

fluorescentes

Limitaciones de los Métodos Directos

No se visualiza la morfología celular

LIMITACIONES

Microorganismos filamentosos

5

Métodos Indirectos

N06/04/2025

2.2. Métodos indirectos

Recuento en Placa

2.2.1. Recuento en placa (viables)

Se basa en el principio de que una única célula viable o unidad

formadora de colonia (UFC) originará una colonia visible, cuando se

siembre en una placa con medio sólido.

Consiste en contar el número de colonias de la placa (que será el

número de UFC) y hacer unos cálculos para determinar el número de

UFC/ml en la muestra original.

Ventajas: fácil, gran sensibilidad, uso de distintos medios que aporten

más información que el simple recuento.

Limitaciones: no siempre adecuado para muestras naturales.

Diluciones y Siembra para Recuento en Placa

Recuento en placa: diluciones y siembra

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml de caldo

Muestra para

1/10

contar

Dilución-+

1/100

(10)

1/103

(10)

1/104

(10+

1/105

(10-5

1/10°

(10)

Muestras de 1 ml

A partir de cada dilución se

inoculan 3 placas con 100ul

Imagen de"Brock Biologia de los Microorganismos". 10ª ed., Madigan, Martinko y

Parker (Prentice Hall)

Demasiadas colonias

colonias

colonias

colonias

colonias

PRÁCTICAS iii

1,59 x 10€

159 x 10^ x 10

Contaje Factor

de

dilución

Células (unidades

formadoras de colonias)

por mililitro de la

muestra original

Filtración por Membrana

2.2.2. Recuento sobre filtros de membrana (Filtración por

membrana) (viables)

Filtro de

membrana

sobre un

La muestra de agua

se pasa a través del

filtro de membrana

(0.45 jam)

Se incuba

durante

24 horas

Colonias

tipicas de

coliformes

Nº UFC/ml

Volumen filtrado

Imagen de "Microbiología", 4ª edición, Prescott, Harley y Klein, ( McGraw Hill)

Método usado cuando la densidad bacteriana

en la muestra problema es baja

Número de colonias

aparecidas en las placas

soporte

de litro

Se retira el filtro

de membrana

y se coloca

en una placa

conteniendo

el medio

apropia0g

159

17

2

0

Número Más Probable (NMP)

606/04/2025

2.2.3. Número más Probable (NMP) (viables)

Método para estimar la densidad de población de una muestra

problema, basado en detectar la presencia o ausencia (tubos

positivos o negativos, turbios o claros) de microorganismos en

réplicas idénticas inoculadas con la muestra original. Se utilizan

medios de cultivo líquidos apropiados.

Para el cálculo del NMP se utiliza la ecuación de Poisson de

distribución al azar de partículas en una muestra-> NMP en tabla.

Tabla de McGrady para NMP

Tabla de McGrady. Número más Probable

Número de tabos con tarbiden

Número de tubos con turbidez

Muestra

de agua

Se inoculan 15 tubos: 5 con 10 ml de la muestra; 5 con 1.0 mL, y 5 con 0.1 mL

7

77777

Caldo concentrado (x 2)

Caldo no concentrado

.

.

-

7,8

-

-

1.4

.

-

4

.

4

+

-

.

-

-

.

.

24.8

10

10

10

10

10

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

(mL)

92.0

160.0

Estos métodos (recuento en placa, filtración y NMP) son considerados

como métodos indirectos para número o recuento

Métodos Indirectos (Continuación)

Actividades Metabólicas y Microcalorimetría

2.2. Métodos indirectos (continuación)

2.2.4.Actividades metabólicas, microcalorimetría,

componentes celulares

Medida de actividades metabólicas (viables)

A

• Tasa de formación de productos metabólicos como gases,

  ácidos.

• Tasa de utilización de un compuesto, como el oxígeno, la

  glucosa

A

Microcalorimetría (viables)

-Cambios en la producción de calor resultante del

metabolismo microbiano.

Medida de Componentes Celulares

> Medida de algún componente celular (totales y viables)

-Cuantificar mediante un método analítico algún componente

celular: Proteínas, ADN, ARN, Nitrógeno, ATP, clorofilas ...

33

1

.

.

4.4

4.9

-

9

4

.

12

-

35.00

54.0

-

1.7

1

0.18

.

#

-

Turbidez, Espectrofotómetro y Escala de MacFarland

706/04/2025

2.2.5. Turbidez. Espectrofotómeto. Escala de MacFarland.

> Las suspensiones bacterianas aparecen turbias porque las

células dispersan la luz que atraviesa la suspensión.

> Cuantas más células haya mayor será la luz dispersada y mayor

será la turbidez.

Ventajas de la Medición de Turbidez

Ventajas:

> Las medidas de turbidez son fáciles y rápidas de realizar.

> No precisan modificación de la muestra, por lo que puede

medirse repetidamente a lo largo del tiempo.

Métodos para Medir Turbidez

¿Cómo medimos turbidez ?:

> Espectrofotómetro

> Escala de MacFarland

75

all: Ame

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plies And Equipment

Uso del Espectrofotómetro

Espectrofotómetro

La turbidez de una suspensión podemos medirla mediante un

espectrofotómetro que hace pasar la luz a través de la

suspensión y mide la cantidad de luz transmitida o no

dispersada ->

(TEMA 12. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN UV-

VISIBLE. Fundamentos teóricos. Espectrofotómetro).

El espectrofotómetro utiliza un prisma de difracción para generar luz

incidente en una banda muy estrecha de longitudes de onda.

Para medir turbidez bacteriana se utiliza /= 540nm (verde),

K= 600nm (naranja) y /= 660nm (rojo).

8