Biotecnología Aplicada a la Salud II: Anticuerpos Monoclonales

BIOTECNOLOGÍA ANIMAL

ANTICUERPOS MONOCLONALES

TEMA 10. BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SALUD II

• ANTICUERPOS MONOCLONALES
• TERAPIAS GÉNICAS

Monocloral
antibody
Proteins on
the cell
Cancer
CANCER CELL
Monodony
antibody
locked omto
the protein
Carvoer Research UN
Hinge/TM
co-stimulatory domain
Gene Therapy Using an
Adenovirus Vector
Non-viral
transfection
methods
Lenti-/Retro-
vina
US Himtonal Library of Medicine
Tumoc
detigen
1
Y T-cell
Tranfection
IM
Leukapheresis
CAR T-cell
Tumor cell
Modified
T-cell expansion
in culture
Re-infusion
into patient
+/-Lymphodepleting
conditioning
1

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Fundamentos inmunológicos

La especificidad de un anticuerpo depende de su región variable: zona con
secuencias de Aa que se unen complementariamente a una molécula Ag
La especificidad de un Ac natural no es absoluta hacia un Ag: posibilidad de
reacciones cruzadas con otros antígenos quimicamente similares
Problema: un Ag es una proteína pesada que
puede tener múltiples epitopos
antibodies
variable
regions
antigen
epitopes
Figure 1. An antibody binds to a specific region on an antigen called
an epitope. A single antigen can have multiple epitopes for different,
specific antibodies.
Un Ag no genera un único Ac, sino tantos
Ac como epitopos tenga
Reacción CRUZADA
Estos Ac se pueden unir a epitopos
químicamente similares de otros Ag
2
1
Cada epitopo puede estimular la producción
de un Ac
NH

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Fundamentos inmunológicos de la reacción cruzada

La REACCIÓN CRUZADA es más probable entre Ag y Ac con baja afinidad o baja
avidez
Afinidad: medida de la fuerza de unión entre el epitopo y la región variable del Ac
Avidez: medida de la fuerza total de todas las interacciones que pueden darse en un
complejo Ag-Ac (es decir, todas las uniones epitopo-Ac para un antígeno
complejo)
Si el Ac tiene una alta afinidad/avidez por un Ag específico, la reacción cruzada es
menos probable
Antigen 2
Antigen 1
Antigen
1
Antigen binding
site
Antigen binding
Antibody with
original
immunogen
Expanded view
of original
antigen-antibody
binding site
interaction
3
Fleshandbones.com Naim: Immunology for Medical Students

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Fundamentos inmunológicos del paratopo

A
B
Common Epitopes
Partial Paratope Engagement
C
D
Flexible Paratope
Low Complexity Epitopes
PARATOPO
Antigen
Epitope
- Receptor especializado
compuesto por un grupo
de amino ácidos en las
regiones V de las cadenas
Hy L, donde se une el Ag.
Antigen-binding site,
- Paratope
Light
chains
Heav
chains
Antibody
(Immunoglobulin, lgG)
4
2
Tipos de reacciones cruzadas
Antigen
2
Antigen
Cross-reactive
antigen -
goodness of fit'
sufficient for
binding

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Obtención de Ac POLICLONALES

Antibodies used for research and diagnostic purposes are often obtained by injecting a lab animal such as a rabbit or a goat with a
specific antigen. Within a few weeks, the animal's immune system will produce high levels of antibodies specific for the antigen. These
antibodies can be harvested in an antiserum, which is whole serum collected from an animal following exposure to an antigen.
Because most antigens are complex structures with multiple epitopes, they result in the production of multiple antibodies in the lab
. - .
. . .
animal. This so-called polyclonal antibody response is also typical of the response to infection by the human immune system.
Antiserum drawn from an animal will thus contain antibodies from multiple clones of B cells, with each B cell responding to a specific
epitope on the antigen (Figure 2).
.
1
Inject antigen
into rabbit.
2 Antigen activates
B cells.
3
Plasma B cells
produce polyclonal
antibodies.
4
Obtain antiserum
from rabbit containing
polyclonal antibodies.
B cells
memory B cells
YYYY
MYYY
secreted
antibodies
antigen
plasma B cells
5

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Obtención de Ac POLICLONALES y maduración por afinidad

Se inyecta a los animales AL MENOS DOS VECES -> R. I. SECUNDARIA por células
de memoria
Se obtienen IgG con mayor afinidad que en la R.I. PRIMARIA > "maduración por
afinidad" (las mutaciones en los genes que codifican para las regiones variables
generan en linf. B ligeras modificaciones en los paratopos, que en la 2ª exposición
serán seleccionados por su mayor afinidad hacia el epitopo)
Estos antisueros no contendrán sólo Ac frente al Ag introducido artificialmente,
sino tambien Ac frente a otros Ag a los que el animal haya sido expuesto
antigen
antibody
Mezcla heterogénea de Ac que obliga a una
purificación previa a su utilización
(diagnóstico, investigación, etc.)
epitopes
nolvelonal anticorum
6
3

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Limitaciones de los Ac POLICLONALES en diagnóstico

· Se utilizan en el DIAGNÓSTICO de enf. infecciosas > titulación de Ac en respuesta a
la presencia de un agente patogeno
. Es una medida indirecta que puede dar lugar a FALSOS POSITIVOS o a FALSOS
NEGATIVOS
· La fiabilidad de un test diagnóstico: SENSIBILIDAD y ESPECIFICIDAD
SENSIBILIDAD:
ESPECIFICIDAD:
Probabilidad de obtener un
resultado (+) en un paciente
realmente infectado
Probabilidad de obtener un
resultado (-) cuando el
paciente NO está infectado
. Los FALSOS NEGATIVOS ocurren por ESCASA SENSIBILIDAD
· Los FALSOS POSITIVOS ocurren por ESCASA ESPECIFICIDAD (reacción cruzada)
7

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Limitaciones de los Ac POLICLONALES: Hepatitis C

· Ej. Hepatitis C : ELISA con mucha sensibilidad, pero poca especificidad >
muchos falsos positivos
Es necesaria una prueba CONFIRMATORIA
Hepatitis C virus RNA
9600 nt bases
Gene encoding precursor polyprotein
Y' NTR
Y' NTR
Basada en la determinación de ARN viral específico
Structural proteins
non structural proteins
98 p27 p56/58 p68
E1
NS4A
N548 NSSA N558
Envelope
proteases
RNA helicase
interferon
nucleocapsid
transmembrane
resisting
protein
protein
· Otras limitaciones:
glycoproteins
· Si el paciente no produce suficientes Ac (inmunodeprimido)
. Se necesita un tiempo para producir Ac suficientes (semanas)
· Persistencia de los Ac después de la curación: ser seropositivo no implica que
la infección esté activa
Siempre hay que contar con la posibilidad de FALSOS
POSITIVOS con Ac policlonales
8
4
co-factors
RNA polymerase

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Obtención de Ac MONOCLONALES

· Son AC CON AFINIDAD POR UN ÚNICO EPITOPO
· No se obtienen de animales, sino de cultivos in vitro
Etapas:
1 .- Inyección del Ag
2 .- Recogida de linf. B (múltiples clones)
Del bazo y ganglios linfáticos
Obtención de un
hibridoma
permanente
monoclonal antibodies
3 .- Fusión con cultivo celular de mieloma (+++
linf. B neoplásicos), mediante pulsos
eléctricos o PEG
Antigen
B cells
Myeloma cells
Screening by ELISA
Immunization
Fusion
HAT selection
4 .- Selección de los hibridomas
(la fusión no es 100% eficiente), en medio
HAT (sólo sobreviven los hibridomas)
Hybirdoma
C
0
VV
Monoclonal antibodies,
expansion and stock
Antibody producing
hybridoma clones
Hybridoma screening for
antibody of interest
9

ANTICUERPOS MONOCLONALES

APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab

ZMR News Magazine
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Technology
Health
Science
Global Monoclonal Antibody Therapeutics Market to
register USD 218.97 Billion by 2023
By Hiren Sam - On Apr 10. 2019
DARSINESS |TECHNOLOGY
1 .- Diagnóstico serológico (ELISA indirecto, sándwich, etc.)
· El reconocimiento de epitopos simples -> aumento de ESPECIFICIDAD
(práctica eliminación de falsos positivos)
Second
Direct Ammay
Indirect Amay
2 .- Recuperación de Ag en muestras complejas
(ej. E. coli O157:H7 en aguas fecales, leucocitos CDxx con Dynabeads;
"ELISA capture Ab")
Mymbar
----
1. Load and spune» praxis
Happydid proteina onto PVDF
Invitropen
--
..
11111
4. Inouben the membrane we
apnotic m primary antibody. Wash
3. Detección de Ag específicos mediante Western Blot
(aumento de especificidad a nivel de epitopo -> eliminación falsos (+)
10
5
!
5 .- Individualización de hibridomas y selección
de clones por Ac deseado

ANTICUERPOS MONOCLONALES

APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab: Terapias

4 .- APLICACIONES TERAPÉUTICAS ("inmunoconjugados" de fármacos, células CAR-T)
· El reconocimiento de epitopos simples -> aumento de ESPECIFICIDAD
celular a la que se dirige la terapia
b Angiogenesis inhibition
c Checkpoint blockade
a Tumour-specific lgG
Tumour
cell
Receptor
T cell
PDL1
Tumour-
antigen
-VEGFR
-VEGF
CTLA4
PD1
1
Naked MAb
Biotinylated
radioactive ligand
3
Multistep Targeting
Effector cell
ADCC
CDC
Streptavidin
laG
Radioimmunoconjugate
d Radioimmunotherapy
g CAR T cells
Cytokine
Immunocytokine
Killer
cell
Immunoconjugates
Antigen-based
retargeting of
cellular immunity
Immunotoxin
Liposome
scFv-enzyme
ADEPT
SCEV
2
Prodrug Drug
Immunoconjugates
e Antibody-drug
conjugate
therapy
f Bispecific
antibody
therapy
CD3
Nature Reviews | Cancer
11

ANTICUERPOS MONOCLONALES

APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab: Terapias con inmunoconjugados

4 .- APLICACIONES TERAPÉUTICAS ("inmunoconjugados")
. El reconocimiento de epitopos simples -> aumento de ESPECIFICIDAD
celular a la que se dirige la terapia
Anti-HER Blocking Monoclonal
Antibodies: Mechanism of Action
. Ligand binds to
receptor
. Blocks ligand binding
. Prevents dimerization
.
Induces dimerization
MAb
P
P
Phosphorylation
P
Akt P
MAPK
BCL21
BAXI
No
M
G,
signaling
G,
S
1 vial
Tumor cell
proliferation
Apoptosis
G4 arrest
Multistep Targeting
Bipedit: Mit ..
Cytokine
Prodrag Drug
Herceptin® 150 mg
powder for concentrate for
solution for infusion
Trastuzumab
Herceptin" 150nl
moeder for intel
Tumor cell
survival
Roche
Tratamiento del cáncer de mama metastásico
12
6
Complement
PDL1-
specific
Ipilimumab Nivolumab
Radionuclide.
Bispecific MAb
Tumor Cell
Cellular Immunoconjugate
Immunoliposome

ANTICUERPOS MONOCLONALES

APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab: Leucemia Linfoblástica Aguda

4 .- APLICACIONES TERAPÉUTICAS ("inmunoconjugados")
· El reconocimiento de epitopos simples -> aun
celular a la que se dirige la terapia
From www.bloodjournal.org by guest on May 13, 2019. For personal use only.
Review Series
ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA
Monoclonal antibodies in acute lymphoblastic leukemia
Elias Jabbour, Susan O'Brien, Farhad Ravandi, and Hagop Kantarjian
Department of Leukemia, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX
Unconjugated
CD19
Unconjugated
Unconjugated
CD22
Conjugated chemotoxin
Conjugated chemotoxin
CD20
Conjugated immunotoxin
CD52
Bi-allelic MoAb
(CD19 & CD3)
Unconjugated: Rituximab, Ofatumumab, Obinutuzumab,
Epratuzumab, Alemtuzumab
Chemotoxin: Calicheamicin, Maytansine, Auristatin
Immunotoxin: Diptheria, Pseudomonas
13
Table 1. Targeted therapies for ALL
Therapy
CD20
Rituximab
Ofatumumab
When added to conventional chemotherapy has
been shown to improve survival in younger adults
Binds to a different epitope than rituximab, which
may allow it to overcome rituximab-resistant
disease
Obinutuzumab
Novel glycoengineered type II CD20 monoclonal
antibody superior to rituximab and ofatumumab
in the induction of direct cell death.
CD19
SAR3419
Conjugated to a synthetic maytansinoid that is
release intracellularly after antigen
SGN-CD19A
Humanized anti-CD19 monoclonal antibody
conjugated to the microtubule-disrupting agent.
G2/M arrest and apoptosis
Blinatumomab
Bispecific antibody that redirects cytotoxic T cells
to cells that express CD19
CD2
Epratuzumab
Studied as part of combination therapy in adults
and children with modest activity
Epratuzumab-SN38
Antibody conjugated to a topoisomerase I inhibitor
to enhance cell kiling potential
Inotuzumab ozogamicin
Moxetumomab
Antibody conjugated to the cytotoxin calicheamicin
CD52
Alemtuzumab
Antibody that has only displayed little activity in
B- and T-cell disease
Table 2. Activity of rituximab in patients with Burkitt leukemia
Percent survival
MDACC9
Germany19
CALGB20
Therapy
4 years
3 years
.4 years
Chemotherapy
50
50
52
Chemotherapy + rituximab
79

ANTICUERPOS MONOCLONALES

APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab: Humanización

Biotechnology
inganeering
APLICACIONES CLÍNICAS de los Mab
ISSN: 0064-8725 (Print) 2016-5556 (Online) Journal homepage: https://www.tandfonline.com/lai/tbgr20
Antibody humanization methods - a review and
update
4 .- APLICACIONES TERAPÉUTICAS ("inmunoconjugados")
Yaghoub Safdari , Safar Farajnia , Mohammad Asgharzadeh & Masoumeh
Khalili
•
Problema ...
Para su aplicación clínica, es necesario
"humanizar" los MAb de ratón
> Los Mab de ratón pueden ser Ag al inyectarse en humanos
se generan Ac neutralizantes que hacen fracasar la terapia
> Para evitarlo, se modifican los genes que regulan las regiones constantes de
las cadenas H y L (CH y CL) de los Mab de ratón en sus linf. B
se obliga a que expresen regiones constantes humanas
Mouse hybridloma
In vitro antibody libraries
Transporio mouse
Mouse
Huminbred
Generic: angrowing
COR grating
14
> Como la región constante es más grande que la variable, el
Mab es "mayoritariamente humano" > minimizar la R.l. en el
paciente humano
Taylor & Franc
Biotechnology and Genetic Engineering Reviews
Description
Antibody conjugated to bacterial or plant toxin
7