Le biotecnologie moderne e le loro applicazioni

Capitolo 4

Le biotecnologie

Sommario

1. Le biotecnologie moderne
2. Le applicazioni delle biotecnologie
3. Gli organismi transgenici e la clonazione

Le biotecnologie moderne

Le biotecnologie sono tutte le tecniche che usano organismi viventi o loro parti per la produzione di beni (alimenti, farmaci) e servizi (diagnostica, medicina forense). Le biotecnologie tradizionali consistono nell'utilizzo di esseri viventi selezionati in base al fenotipo. Le biotecnologie moderne si basano sull'utilizzo di parti di esseri viventi (tessuti, cellule, molecole) oppure sulla produzione di organismi geneticamente modificati sulla base del loro genotipo. In sulli

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Le biotecnologie moderne: Ingegneria genetica

Grazie alle scoperte fatte nel corso del Novecento, si è capito come intervenire sui singoli geni, modificandoli con una serie di tecniche di laboratorio dette di tecnologia del DNA ricombinante o ingegneria genetica. La tecnologia del DNA ricombinante consiste nel tagliare sequenze di DNA di origine diversa in siti specifici, per poi legarle insieme a formare una nuova molecola di DNA, che verrà trasferita nel genoma di altre cellule. Un DNA ricombinante è una molecola di DNA in cui è presente un'informazione genetica proveniente da due o più organismi differenti. Per ottenere questo risultato servono:

• una serie di enzimi di restrizione;
• un gene esogeno, estratto da un organismo diverso;
• l'enzima DNA ligasi, che catalizza la formazione del legame;
• un vettore di clonaggio, che può incorporare il gene esogeno.

Gli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione si usano per isolare tratti scelti di DNA (come un determinato gene) dal resto della molecola, idrolizzando il legame fosfodiesterico che unisce due nucleotidi adiacenti in corrispondenza di specifiche sequenze bersaglio dette siti di restrizione.

1. L'enzima taglia i due filamenti di DNA in corrispondenza di due diversi punti di una sequenza di riconoscimento palindroma. TCCAGGAATTCAT AGGTCCTTAAG ACCA G AT CTCTAGAATTCTTCTAG GAGATCTTAAGAAGATC
2. I filamenti separati sono provvisti di estremità coesive a singolo filamento. TCCAGGA AGGTCCTTAAG ATTCATACCA TATGGT CTCTAGA GAGATCTTAAG ATTCTTCTAG AAGATC DNA TCCAGGAATTCTTCTAG ligasi AAGATC AGGT A DNA ligasi
3. I due frammenti si riuniscono spontaneamente tramite legami a idrogeno tra le estremità coesive; la DNA ligasi salda i legami tra i frammenti.

L'elettroforesi su gel

L'elettroforesi su gel è una tecnica per isolare le biomolecole, che permette di separare frammenti di DNA o proteine in base alle loro dimensioni, mediante un campo elettrico. generatore di tensione polo gel di agarosio polo + - cella elettroforetica soluzione elettrolitica La corsa sul gel separa i frammenti di restrizione di ciascun campione. I campioni sono visibili grazie a una sonda fluorescente.

Clonaggio genico

I frammenti di DNA isolati vengono trasferiti nella cellula ricevente tramite un vettore di clonaggio. I plasmidi batterici, opportunamente modificati, sono il mezzo ideale. Questa tecnica è anche chiamata clonaggio genico, in quanto permette di ottenere molte copie identiche del gene di interesse in un sistema batterico. DNA campione C C taglio con un enzima Y di restrizione - miscela dei frammenti con il DNA plasmidico, tagliato con lo stesso enzima di restrizione la miscela di cellule è sparsa su un mezzo contenente antibiotico Trasformazione batterica: solamente alcune cellule incorporano il DNA plasmidico. le cellule contenenti i plasmidi si moltiplicano e formano colonie aggiunta dell'enzima ligasi D si isola il DNA plasmidico e lo si analizza

La PCR

La PCR o reazione a catena della polimerasi è una tecnica che ha lo scopo di amplificare il DNA, cioè produrre molte copie a doppio filamento di una specifica sequenza.

1. Una molecola di DNA, contenente una sequenza che si desidera copiare, viene riscaldata a 90 ℃ e così denaturata.
2. Quando la miscela si raffredda, i primer si associano al DNA a filamento singolo.
3. I nucleotidi trifosfato e una DNA polimerasi resistente al calore consentono la sintesi di due nuovi filamenti di DNA.
4. Il processo viene ripetuto e la quantità di DNA raddoppia a ogni ciclo.
5. Grazie alla ripetizione del processo si ottengono milioni di copie del frammento di DNA originario in poco tempo. 1 - primer nuovo DNA 1 5' 3' 5' 1 sequenza da amplificare 1 - 1 1 1 J 1 1

Genoteche e ibridazione

· I frammenti di DNA utilizzati nelle procedure di ingegneria genetica provengono da varie fonti. In molte tecniche si ricorre alle biblioteche genomiche o genoteche. · Una genoteca è una raccolta di geni o frammenti genici estratti dal DNA di una cellula, ciascuno inserito in un vettore come un plasmide batterico. · Per identificare e isolare la sequenza di basi di un frammento all'interno di una genoteca, si può sfruttare la proprietà del DNA a singola elica di legarsi a un filamento con sequenza complementare. Questa proprietà è chiamata ibridazione e il filamento complementare è detto sonda a DNA.

Il sequenziamento del DNA

Il sequenziamento del DNA è una tecnica consente di determinare la sequenza nucleotidica di un tratto di DNA o di un intero genoma. Con il metodo Sanger è possibile ottenere tanti frammenti di DNA che differiscono per una sola base e possono essere separati e poi riordinati per ricavare la sequenza completa del DNA di partenza.

1. Si digerisce il genoma con enzimi di restrizione. Il frammento da sequenziare viene denaturato per ottenere un singolo filamento. 3' 5 3' AACAGCCTTCAAGT 5'
2. Si suddividono i frammenti di DNA + 5' TTGT 3' primer in quattro provette, ciascuna contenente il primer, la DNA polimerasi, + DNA polimerasi + dATP, dCTP, dTTP, dGTP + ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP
3. Si procede con l'incubazione. In ogni miscela si formano frammenti di lunghezza diversa, a seconda del punto in cui l'allungamento è stato interrotto dal didesossinucleotide. ddATP ddCTP ddTTP ddGTP TTGTCGGA TTGTC TTGTCGGAAGT TTGTCG TTGTCGGAA TTGTCGGAAGTT TTGTCGG TTGTCGGAAG TTGTCGGAAGTTCA
4. Si caricano i prodotti delle quattro reazioni nei pozzetti di un gel per l'analisi elettroforetica. =
5. Procedendo dal frammento più piccolo (in basso) verso il più grande (in alto), si ricostruisce l'ordine con cui i nucleotidi sono stati incorporati. DNA sequenziato - T ACT G primer
6. La sequenza che emerge è complementare a quella che si intendeva sequenziare. i desossinucleotidi e uno dei quattro didesossinucleotidi.

Sequenziatori automatici

I sequenziatori automatici sfruttano la tecnica di Sanger con alcune modifiche per renderla più veloce e automatizzata. Il genoma viene diviso in frammenti lunghi alcune centinaia di nucleotidi e in parte sovrapponibili; poi i frammenti vengono amplificati tramite PCR, utilizzando dei nucleotidi fluorescenti di colore diverso per ciascuna delle basi. Ogni volta che nella reazione di PCR è incorporato un nucleotide fluorescente, un raggio laser ne registra il colore e invia i dati a un computer, che li esprime mediante diagrammi chiamati elettroferogrammi. CATGAAGCATAAAGTGTACAT ---

RT-PCR e test molecolari

L'RT-PCR è una versione della PCR con cui è possibile convertire in DNA un intero trascrittoma, cioè l'insieme degli RNA trascritti di una cellula di un preciso tessuto, in una specifica fase del suo sviluppo. Il risultato può essere quantificato con la real time PCR. Questa tecnica misura l'andamento della reazione di amplificazione in tempo reale ed è basata sulla misura dell'emissione di fluorescenza a mano a mano che le molecole di DNA aumentano nel campione. Una delle applicazioni sono i test molecolari per la ricerca del virus SARS-CoV-2:

• i test molecolari individuano l'RNA virale nei fluidi del paziente;
• i test antigenici individuano gli antigeni virali, cioè alcune proteine espresse sulla superficie della particella virale;
• i test sierologici rilevano la presenza nel sangue di anticorpi specifici, responsabili della difesa immunitaria.

Editing genetico con CRISPR/Cas9

Oggi è possibile inserire, silenziare, sostituire o eliminare un gene è un tipo di ingegneria genetica chiamato editing genetico. Il metodo alla base è il sistema CRISPR/Cas9, basato su una serie di enzimi tipici dei batteri.

1. Un RNA a guida singola e Cas9 vengono uniti. Il complesso RNA- Cas9 riconosce i frammenti di DNA da modificare. RNA
2. L'RNA a guida singola marca una specifica sequenza genica e porta in quel sito l'endonucleasi Cas9. DNA Cas9 siti d'azione dell'endonucleasi Cas9
3. Cas9 agisce come una forbice molecolare e taglia la specifica sequenza di DNA nella doppia elica.
4. Il DNA è stato modificato; per esempio, un gene responsabile di una malattia può essere silenziato oppure un gene mutato viene corretto inserendo la giusta sequenza di DNA.

Le applicazioni delle biotecnologie

ambientali e per il trattamento dei rifiuti marine e per le acque dolci agrarie e vegetali forensi biotecnologie alimentari industriali bioinformatiche biomediche e farmaceutiche Il biorisanamento consiste nella bonifica di un ambiente inquinato da parte di microrganismi specifici. Le principali tecniche sono:

• la biostimolazione, che consiste nell'aggiungere nutrienti per stimolare la crescita di microbi già presenti;
• la bioaugmentation, che consiste nell'aggiungere dall'esterno batteri solitamente non presenti nell'ambiente da bonificare, ma capaci di risanarlo.

Biotecnologie e energie rinnovabili

·Le biotecnologie sono impiegate anche per la ricerca nel settore delle energie rinnovabili. Tra le applicazioni del settore ricordiamo la produzione di:

• biocombustibili, cioè combustibili che derivano dalla coltivazione di mais, canna da zucchero, alghe e altri prodotti o scarti agricoli;
• bioetanolo, ottenuto dalla fermentazione delle biomasse ricche di carboidrati (canna da zucchero, vinacce, mais) e anche dalla cellulosa. Grown for Biofuel

I biocarburanti si possono anche ottenere da alghe e microalghe, da cui si ricavano olio, combustibili e miscele di gasolio.