Biochimica Agraria: Regolazione dell'attività enzimatica e metabolica

Regolazione dell'attività Enzimatica

Non è concepibile che, nell'ambito di un organello cellulare o del citoplasma, l'attività di tutte le proteine enzimatiche presenti siano contemporaneamente portate alla massima velocità Le diverse velocità che una reazione enzimatica può raggiungere nel contesto di un processo vitale devono essere strettamente collegate ad altre velocità di altre reazioni enzimatiche condotte da altri E e vi deve essere la possibilità di regolare questi fenomeni in modo che la via metabolica possa essere rallentata, bloccata o velocizzata in funzione delle necessità dell'organismo.

Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività enzimatiche siano regolate Ciò consente di:

• non produrre prodotti inutili
• economizzare l'energia cellulare
• aumentare rapidamente l'attività quando necessario

1 L'enzima favorisce il raggiungimento dell'equilibrio, quindi in teoria potrebbe catalizzare anche la reazione inversa A = B Se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile A -> B - C Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche) A -> B -> CD -E Anche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili (specie quelle con AG&0), in pratica il flusso è unidirezionale perché il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva Spesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A -> B

2 125/10/2022 Biochimica Agraria - Regolazione

Regolazione dei processi metabolici

1. Controllo metabolico grezzo (lento)
2. Controllo metabolico fine (veloce)

Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie

• AG«O (maggior efficacia)
• Precoci nella catena enzimatica
• Inibizione o regolazione da parte del prodotto finale
• Gli enzimi coinvolti sono spesso multimerici

3

Controllo metabolico grezzo

Controllo che necessita di periodi di tempo che vanno da qualche decina di minuti o ore fino a periodi di adattamento che possono essere dell'ordine dei giorni Tempi così relativamente lunghi perché la regolazione necessita di neo-sintesi di E o degradazione di E che già erano presenti (controllo basato su aspetti quantitativi dell'E) Due componenti:

1. Attivazione dell' espressione di geni codificanti per l'E
2. Alternativamente, demolizione di E pre-esistenti ad opera di proteasi

In funzione della velocità con cui le due componenti operano, si potrà avere o un aumento di quantità di un certo E (e quindi di attività) oppure una sua diminuzione.

25 umol g-1FW h-1 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 [S] 4 2Biochimica Agraria - Regolazione 25/10/2022

Assorbimento dell'azoto

L'assorbimento di nitrato è mediato da trasportatori ed avviene attraverso meccanismi di simporto 2H+/1NO3" Assorbimento radicale del nitrato NO3- Nitrate transporter 2 H+ NO3 Nel sistema radice-suolo, salvo situazioni particolari, l' assorbimento del nitrato da parte degli apparati radicali costituisce un processo di trasporto attivo secondario (è necessaria quindi una fonte di E per il trasporto dell'anione attraverso la membrana) che coinvolgerebbe la H .- ATPasi della membrana plasmatica L'H+-ATPasi di membrana, estrudendo H+ all'esterno delle cellule, crea un gradiente di pH ed elettrico. Il trasportatore del nitrato co-trasportando 2 o più H+ per ciascuna molecola di NO3", garantisce l' influsso del nutriente nella cellula contro gradiente di concentrazione (~1mM Vs 20mM) e di carica (~ - 120mV nel citoplasma).

+ H ADP + P Nitrate transporter 2 H+ NO3 5

Assorbimento radicale del nitrato: Substrato inducibile

• Dipendente da Energia

35 moles NO3- x g-1 x h-1 30 25 - 20 15 + 10 - 5 0 0 4 8 12 16 20 24 hours Il contatto della radice con il nitrato determina nell'arco di circa 1-2h un aumento dei trascritti del gene che codifica per il trasportatore di nitrato (NRT2) e dopo 3-4h un aumento fisiologico della capacità della radice di assorbire l'anione AtNRT2.1 Transcript Abundance Altro es. Nitrato Riduttasi 6 3 ATPBiochimica Agraria - Regolazione 25/10/2022

Assorbimento radicale del nitrato e attività H+-ATPasica

ATPH ADP + P Nitrate transporter 2 H+ NO2- H Assorbimento di nitrato 35 30 - 25 - 20 - 15 2 10 - 5 - 0 0 4 CO 12 16 20 24 hours 90 mmoles Pi x g1 x h1 80 Attività H+-ATPasica 70 60 50 40 - 30 ( 20 , 10 - 0 0 4 8 12 16 20 24 hours 7

Diminuzione dell'attività

1. Processo di demolizione delle proteine (degradazione da parte delle proteasi)
2. Segnali interni al metabolismo che regolano in modo negativo il gene che codifica per l' E che era stato attivato

Es. Nitrato: al suo ingresso nel citoplasma segue la riduzione ed assimilazione. Le forme ridotte (glutammina) sono il segnale che regola negativamente la capacità di assorbire l'anione indotta dal contatto della radice con il nitrato.

NO3 NO3NO2-NH4+ - Glutammina Induzione Repressione Nucleus NRT2.1 trascritti (unità relative) R = 0.76 [Glutammina] umol (gFW)-1 8 4 Regolazione a livello trascrizionale dei geni che codificano per i trasportatori del nitrato e per l'H+- ATPasi moles NO3- x g-1 x h-1 -Biochimica Agraria - Regolazione 25/10/2022

Trasformazione da zimogeno (pro-enzima) in enzima attivo

GLN LEUSENOLY LAGES PROGLYS 60 LEÙ 14H SER 1 A - Chain ASP COO GL YS 20 ASN COO- ARG G.NCYSCUSTunSET PRO FILE ARG THR B-Chain PHE PLNCYS CYSTHR SER ILE CYSSEPLEU TYROLNLEU CLUASH TYRCYS LYS TU 19 B-Chein PHE VAL 1 PHE GLN Prainsulin ASN YAL 1 PHE Irystratyale proinsulina insulina 9

Chimotripsinogeno e chimotripsina

Chimotripsinogeno -> chimotripsina 136 201 245 Chimotripsinogeno (inattivo) 1 122 Cys S-S- Cys tripsina Arg "-Chimotripsina (attiva) 1 15 16 S-S -5-S chimotripsina Ser Arg Thr Asn 14 15 + 147 148 Tyr Ala Leu Ile 149 1 13 122 16 -S-S- S-S 10 136 146 201 245 a-Chimotripsina (attiva) 2 GLY LUARG 20 + C-Peptide VAI 30 THR TYR -coo- GLU LYS A -Chain TYR PHE 136 201 245 122 proinsulina -> insulina 525/10/2022 Biochimica Agraria - Regolazione

Tripsinogeno e tripsina

Tripsinogeno (inattivo) 1 6 7 1 1 Val-(Asp)4 -Lys -Ile- enteropeptidasi Val-(Asp)4 -Lys Tripsina (attiva) 7 245 1 Ile 11

Modulazione dell'attività dell'enzima

Regolazione fine (veloce e reversibile)

• pH
• Temperatura
• Inibizione reversibile ed irreversibile:
  • Competitiva
  • Non-competitiva
  • Incompetitiva
• Modificazioni allosteriche
• Modificazioni covalenti
• Concentrazione substratto/prodotto

12 6Biochimica Agraria - Regolazione 25/10/2022

Controllo metabolico fine

Controllo che consente di regolare velocità di reazioni enzimatiche, con riflessi di tipo fisiologico sul funzionamento di un tessuto o cellula, in tempi brevissimi (minuti o anche secondi) Due esempi di modalità di controllo:

1. Modificare la [S]
2. Modificare il valore di pH al quale l' E lavora

Modificare la [S]

Gli E lavorano preferenzialmente al valore di [S] prossimo al valore numerico di Km. In queste condizioni, piccole variazioni di [S] possono determinare significative variazioni di attività dell'E

25 20 15 Vo 10 5 0 0 2 4 6 [S] 13

Modificare il valore di pH

Gli E in genere hanno un ottimo di pH vicino a quello dell'ambiente in cui operano. log Va log Vo 2 4 6 6 8 10 PH PH Tuttavia, vicino non significa che corrisponde; inoltre non è detto che il valore di pH rimanga sempre costante in quel determinato compartimento Velocità della reazione (Vo) Pepsina Tripsina Fosfatasi alcalina 3 5 7 9 11 PH 14 7Biochimica Agraria - Regolazione 25/10/2022

Modello chemiosmotico

2000 2H 4H* A Cite + + + IV C III II *H2O Fumarato 02 +2H* Suecinato ADP + Pi NADH + H* NAD* F Matrice F ATP Gradiente chimico Sintesi Potenziale elettrico ApH dalla forza Δψ (l'interno è alcalino) motrice protonica (l'interno è negativo) Modello chemiosmotico. In questa semplice versione della teoria chemiosmotica applicata ai mitocondri, gli elettroni presenti sul NADH o su altri substrati ossidabili passano attraverso una catena di trasportatori disposti in modo asimmetrico nella membrana interna. Il flusso degli elettroni è accompagnato da una traslocazione di protoni attraverso la membrana mitocondriale, che produce un gradiente chimico (ApH) e un gradiente elettrico (Av). La membrana mitocondriale interna è impermeabile ai protoni e per rientrare questi devono attraversare i canali proteici specifici del complesso F .. La forza motrice protonica che spinge i protoni wirso la matrice fornisce l'energia per la sintesi di ATP, catalizzata dal complesso Fi associato ad F 15

Enzimi coinvolti nella fissazione della CO2

Enzimi coinvolti nella fissazione della C02 (fase oscura della fotosintesi) sono più attivi a pH alcalini dello stroma membrana esterna del cloroplasto membrana interna del cloroplasto CO luce P + ADP ATP ciclo di Calvin H'+ NADP' NADPH 2 2 1[ +1/202 zuccheri reazioni luce-dipendenti (membrana del tilacoide) reazioni luce-indipendenti (stroma) 16 8 Enzimi del ciclo degli acidi tricarbossilici sono più attivi a pH alcalini della matrice del mitocondrio 4H+ Spazio intermembrana di ATP guidata25/10/2022 Biochimica Agraria - Regolazione

Enzimi regolatori

• Sono Enzimi capaci di modulare la propria attività catalitica, Negativamente o Positivamente, in risposta a certi segnali (sono E che in maniera più efficace possono subire o possono manifestare variazioni nella loro attività in seguito a qualche tipo di modificazione esterna)
• Sono spesso coinvolti nelle principali attività metaboliche e catalizzano reazioni chiave dei processi metabolici, regolando l'intero andamento del processo
• Normalmente un Enzima regolatore catalizza la prima reazione di una sequenza metabolica costituita, è quindi il primo E di un sistema multienzimatico

Tipi di enzimi regolatori

POSSONO ESSERE:

1. MODIFICATI DAL LEGAME COVALENTE reversibile con piccole molecole (es. fosforilazioni, legame con ubiquitina o glutatione).
2. ALLOSTERICI (diversa forma): l'azione viene regolata dal legame (con forze deboli) reversibile, non covalente di piccole molecole in un sito diverso da quello attivo (tale legame determina una modificazione transitoria e reversibile della conformazione del enzima)

Entrambi questi due tipi di enzimi sono proteine caratterizzate da una struttura quaternaria, quindi dotate di piu' subunita'. Il comportamento cinetico degli enzimi regolatori è dovuto a interazioni cooperative tra le subunità di enzima. 17

Enzimi allosterici

Allosterismo

• allo = altro
• Attività enzimatica sotto il controllo di un modulatore
• Classe K o V: altera Km o Vmax
• Inibitore o stimolatore
• Interazione omotropica: il modulatore è lo stesso substrato
• Interazione eterotropica: il modulatore è diverso dal substrato

Jacques Monod Nobel Prize 1965 18 9