Metodi e Tecniche di Istologia e Anatomia Patologica per l'università

Cos'è l'anatomia patologica?

Anello di congiunzione tra le scienze biologiche di base e la medicina pratica Studia le alterazioni strutturali e funzionali prodotte dagli eventi patologici o dagli errori congeniti, ovvero la malattia

Componenti del Processo di Analisi Patologica

Prodotto in ingresso: campioni biologico da esaminare Attività compiute rispettando determinati standard Prodotto in uscita: il referto diagnostico (descrizione macroscopica e microscopica lesioni osservate ed il giudizio sintetico e conclusivo-diagnosi dell'esaminatore)

Cosa esamina l'anatomia patologica?

Pezzi chirurgici Biopsie (frammento di un organo) Organi e tessuti autoptici

Diagnosi Istologica

7 C Materiale citologico DIAGNOSI CITOLOGICA Si osservano solo cellule e non i componenti extra-cellulari del tessuto

Le procedure impiegate

• Esame Macroscopico (es., per i pezzi operatori permette di identificare, descrivere, e selezionare le aree di tessuto interessate da malattia che andranno prelevate per l'esame istologico).
• Esame Istologico (esaminare al microscopio ottico i tessuti normali-istologia- o patologici- istopatologia- utilizzando tecniche di colorazione di routine)

Esame Citologico/Citopatologico

• Esame di istochimica (utilizzo di test fisico/chimici per identificazione di sostanze in cellule e tessuti)

Esame di Immunoistochimica

• Esame di microscopia elettronica

Ibridazione in Situ Citogenetica tissutale

• Citofluorimetria a flusso

Iter dell'esame istopatologico

Richiesta Accettazione Personale amministrativo e tecnici di laboratorio (TLB) Esame macroscopico e campionamento Patologi e TLB Processazione e allestimento dei preparati istologici TLB Taglio delle sezioni al microtomo } TLB Colorazioni standard, istochimiche, immunoistochimiche TLB Diagnosi istopatologica Patologi O Invio delle diagnosi al richiedente amministrativi

Trasporto campione in Anatomia Patologica

In barattoli con formalina (volume 10 volte quello del campione) A fresco, sottovuoto - esame intraoperatorio - biopsie renali - campioni destinati alla biologia molecolare - biopsie per immunofluorescenza - i linfonodi per sospetta patologia linfoproliferativa

Accettazione e registrazione

O Corrispondenza tra quanto scritto in richiesta (materiali, anagrafica, sede) e quanto scritto nell'etichetta sui barattoli Materiale a fresco o con liquidi fissativi Ad ogni esame viene assegnato un numero progressivo (es. 20IST0100)

Esame macroscopico

Rappresenta la certificazione dell'attività del chirurgo, puntualizzando cosa è stato asportato al paziente e come l'intervento è stato eseguito Descrizione visiva del campione ricevuto: Tipo di campione (biopsia, resezione chirurgica) Dimensioni Peso ] Eventuali lesioni e loro descrizione (dimensioni, colore, forma, consistenza, distanza dai margini resezione ... )

Campionamento pezzi operatori

O prelievo di porzioni dell'organo rappresentative (lesione, margini di resezione ... ) da cui verranno tagliate successivamente le sezioni istologiche che osserverò al microscopio Varia in base al quesito clinico e a quanto riscontrato macroscopicamente Nel campionamento la dissezione del pezzo va eseguita seguendo il piano di taglio che voglio osservare al microscopio I prelievi, delle dimensioni massime di 2 x1 cm e dello spessore massimo di 0.5 cm, vengono posti in cestelli (biocassette) nei quali subiranno la processazione ed inclusione O Dal campione dobbiamo ottenere sezioni dello spessore di 4-5 um , che possano essere attraversate dalla luce per l'osservazione al microscopio ottico

Preservazione della struttura

Quando un organo viene prelevato, il tessuto va incontro ad un processo di autolisi All'interno del citoplasma della cellula, nei lisosomi, sono presenti degli enzimi litici che vengono rilasciati e «digeriscono» il tessuto Se questo processo non viene arrestato, al microscopio non vedremmo più la sua morfologia La fissazione tissutale consiste nella interruzione dei processi degradativi che compaiono dopo la morte cellulare (autolisi e putrefazione) ed ha lo scopo di preservare l'architettura e la composizione cellulare Dal campione dobbiamo ottenere sezioni dello spessore di 4-5 um , che possano essere attraversate dalla luce per l'osservazione al microscopio ottico

Fissativi

Fissativi Fisici

• Congelamento (criofissazione) del campione tissutale
• Disseccazione a temperatura ambiente del materiale citologico

Fissativi Chimici

• Coagulanti (Etanolo (95%), Metanolo, Acetone)
• Gelificanti (Formaldeide, Paraformaldeide)

Fissativi fisici

Congelamento (criofissazione)

Vantaggi

Rapidità Preservazione degli acidi nucleici e delle proteine Si evita la processazione DIAGNOSTICA ESTEMPORANEA (INTRA-OPERATORIA) CRIOCONSERVAZIONE O CRIOPERSERVAZIONE

Svantaggi

Perdita dei dettagli morfologici (artefatti da congelamento)

Congelamento (criofissazione)

La bassa temperatura blocca l'azione enzimatica campioni di piccole dimensioni (max 4 mm di spessore) deve avvenire in modo rapido per diminuire lo shock termico e prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio I tessuti contengono molta acqua, intra- ed extra-cellulare. Quando l'acqua congela aumenta di volume formando cristalli. La dimensione dei cristalli è maggiore in tessuti con molta acqua e se la velocità del congelamento è bassa

Congelamento

Azoto liquido

• Congelamento molto rapido a -180 ℃
• Rischioso per operatore
• Poco usato in istopatologia
• Usato per stoccaggio colture cellulari o campioni per analisi molecolari

Criostato

Congelamento e taglio

Cos'è un esame intra-operatorio?

• Sinonimi: esame estemporaneo, al congelatore, al criostato
• Definizione: esame istologico con prelievo e diagnosi effettuati durante un intervento chirurgico

. Obiettivo: fornire al chirurgo una diagnosi istologica che possa orientare la prosecuzione della procedura chirurgica

Indicazioni per esame intra-operatorio

• Tutti i casi in cui la risposta modificherà la procedura chirurgica
• Evitare successivi interventi chirurgici
• Stabilire lo stato di resezione dei margini chirurgici
• Assenza di una diagnosi pre-operatoria
• Stabilire l'adeguatezza di un campione prelevato durante una procedura complessa
• Reperti inaspettati durante l'intervento chirurgico
• Valutazione idoneità organi per trapianto

Indicazioni inappropriate per esame intra-operatorio

• Curiosità del chirurgo
• Dare una diagnosi al risveglio al paziente

Alla fine dell'intervento ecco la sua diagnosi!

Procedura

• richiesta e invio
• esame macroscopico
• congelamento e taglio di sezioni dello spessore di micron al criostato
• colorazione : Ematossilina-eosina rapida, Colorazioni speciali (oil red, PAS)

Congelamento

La bassa temperatura blocca l'azione enzimatica campioni di piccole dimensioni (max 4 mm di spessore) deve avvenire in modo rapido per diminuire lo shock termico e prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio

Mezzo di inclusione: OCT

• E' una sostanza gelatinosa a temperatura ambiente, che solidifica a freddo
• E' un crioprotettivo: non penetra nei tessuti, ma circonda il frammento per "proteggerlo" dal trauma del congelamento
• Indurendosi col freddo, fa da supporto per il taglio al criostato

Limiti

O artefatti da congelamento - I tessuti contengono molta acqua, intra- ed extra-cellulare. - Quando l'acqua congela aumenta di volume formando cristalli. - La dimensione dei cristalli è maggiore in tessuti con molta acqua e se la velocità del congelamento è bassa Approccio citopatologico alternativo/aggiuntivo alla sezione criostatica per una diagnosi estemporanea Per limitare artefatti, si può fare una breve fissazione in formalina salata (10%) a 60℃ per 10 min Impossibilità di eseguire immunoistochimica

Esame estemporaneo: approccio citopatologico

Apposizione

• Apporre il vetrino sul campione oppure
• Prendere il campione con le pinze e apporre due volte sul vetrino (in caso di lesioni più dure)

Schiacciamento

STRISCIO

• Sezionare non più di 1 mm3 di tessuto e posizionarlo sul vetrino
• Schiacciare con un secondo vetrino perpendicolare o parallelo
• Esercitare una pressione ottimale e strisciare
• Rapida fissazione alcool etilico 95%
• Colorazione E-E

Dopo l'esame intra-operatorio

• Il frammento congelato viene fissato in formalina
• Eventuale esecuzione di ulteriori prelievi
• Processazione istologica
• Preparato istologico definitivo
• Eventuale conferma o precisazione della diagnosi intra-operatoria

Fasi salienti per l'allestimento di un preparato istologico dopo l'esame macroscopico e l'eventuale dissezione macroscopica:

• Fissazione
• Processazione (disidratazione, diafanizzazione, impregnazione, inclusione)
• Taglio
• Colorazione standard in istologia

Fissazione

> Consiste nel sottoporre il tessuto ad agenti chimici e ad agenti fisici (più raramente) che denaturano rapidamente le proteine, legandosi ai numerosissimi gruppi funzionali e che rendono insolubili gli altri costituenti per le successive fasi di disidratazione, inclusione e colorazione. I migliori fissativi sono quelli che precipitano le proteine nella forma più fine, possibilmente in allegati ultra microscopici, così che la morfologia non sia modificata. > I fissativi bloccano l'attività di enzimi senza alterare le proprietà del tessuto (minimizza la degradazione del campione), interrompendo l'autolisi (rottura della membrana lisosomiale), la putrefazione (batteri saprofiti ed ambientali) e il rigonfiamento a carico dei mitocondri definito torbido o degenerazione albuminoidea. Inoltre, la fissazione consente la protezione dall'azione di microrganismi che possono invadere il tessuto durante il processo di asportazione. > Fissativo deve penetrare dall'esterno verso l'interno e ad alcuni parametri sono determinanti: (i) spessore (non superiore a 1/2 cm); (ii) temperatura (ideale 4 ℃); (iii) pH e pressione osmotica (pH 7.4 e soluzioni isotoniche); (iv) natura del tessuto (tanto più compatto tanto più difficile la penetrazione)

Fissativi chimici

Fissativi Coagulanti

Formano legami stretti tra i gruppi idrofilici delle proteine (coagulazione delle proteine), impedendo che questi interagiscano con le molecole d'acqua. In questa maniera, si blocca l'azione degli enzimi (che sono proteine) perché questi agiscono sul substrato solo in presenza di acqua. · Etanolo (95°) · Metanolo · Acetone

Fissativi Gelificanti

Agiscono stabilizzando le proteine mediante la formazione di ponti proteici (gelificazione), senza allontanare l'acqua dalle cellule. Si rendono £ così inaccessibili i siti di clivaggio agli enzimi. «Gelificando» il tessuto, (lo induriscono). · Acido Picrico · Aldeide Formica (Formaldeide) · Aldeide Glutarica (Glutaraldeide) · Formaldeide · Glutaraldeide