Citogenetica: basi teoriche e protocollo sperimentale, Unibs

Cos'è lo studio citogenetico?

L'analisi citogenetica (o mappa cromosomica o cariotipo) è lo studio dei cromosomi delle cellule. I cromosomi contengono i geni che sono costituiti da DNA, la molecola che contiene tutte le informazioni necessarie per la "costruzione" dell'individuo e il funzionamento dell'organismo. Normalmente al microscopio il DNA non si vede poiché è tutto srotolato sotto forma di cromatina, ma essendo un filamento molto lungo sarebbe molto complicato per la cellula gestirlo se fosse un unico filamento. È perciò suddiviso in pezzi e associato a proteine formando i cosiddetti cromosomi.

Cromatina e cromosomi

X C D A B X L'insieme completo di tutti i cromosomi metafasici di una cellula è definito cariotipo: solo nel 1956 fu accertata la stabilità del cariotipo, ossia del numero e della struttura dei cromosomi. Il cariotipo è infatti specie-specifico e quello umano normale diploide è costituito da 46 cromosomi (23 coppie): 23 cromosomi provengono dal padre con lo spermatozoo e 23 dalla madre con la cellula uovo. Spermatozoi e cellule uovo sono cellule germinali e sono le uniche a contenere solo 23 cromosomi. Se lo spermatozoo porta il cromosoma X nascerà una femmina, se porta il cromosoma Y nascerà un maschio. Il cariotipo di una femmina normale sarà quindi 46,XX mentre quello di un maschio 46,XY. Per studiare i cromosomi è necessario utilizzare tecniche di coltura in quanto solo durante la divisione cellulare è possibile visualizzarli ed in particolare durante la metafase che è la fase del ciclo in cui i cromosomi sono maggiormente condensati.Mitosi

Mitosi e riproduzione asessuata

La mitosi (detta anche cariocinesi) è un processo di riproduzione asessuata delle cellule eucariote grazie al quale da una singola cellula si formano 2 cellule figlie geneticamente identiche alla progenitrice e fra loro.

• Due cellule diploidi

Replicazione del DNA e fasi del ciclo cellulare

Replicazione del DNA Mitosi Fase G1 La cellula sintetizza proteine e altre molecole ma non DNA. L'unica fase che può variare in durata La METAFASE , durante la MITOSI, è il punto del ciclo cellulare che ci interessa Fase S di sintesi del DNA INTERFASE ASE G sintesi di RNA e proteine S sintesi del DNA e duplicazione dei cromosomi G2 sintesi di proteine M mitosi FASE G2 Altra fase Gap cioè in cui non si sintetizza DNA. La cellula continua la sintesi delle proteine, comprese quelle necessarie alla mitosi telofase anafase metafase profase GO Blocco del Ciclo M 62 G1 SA cosa serve la citogenetica?

A cosa serve la citogenetica?

Lo studio citogenetico serve a determinare il numero e la struttura dei cromosomi. Permette quindi di verificare che non ci siano alterazioni del numero e/o della struttura dei cromosomi che possono essere responsabili di malattie caratterizzate da ritardo mentale (es: Sindrome di Down), infertilità/sterilità (es: Sindromi di Turner e Klinefelter), ritardo psicomotorio e del linguaggio, della crescita e dello sviluppo. Le cellule germinali vengono prodotte a partire da cellule con 46 cromosomi attraverso una divisione cellulare molto complicata (meiosi) durante la quale possono avvenire errori di distribuzione dei cromosomi nelle cellule germinali (non disgiunzione). L'età materna è uno dei principali fattori che aumenta la probabilità della non disgiunzione e l'unico fattore dimostrato realmente importante nella Sindrome di Down o trisomia 21 (caratterizzata dalla presenza di tre cromosomi 21 e quindi 47 cromosomi totali). Il rischio di avere un figlio affetto da Sindrome di Down per una donna di 25 anni è 0.8% mentre per una donna di 35 è 2.7%, a 40 anni il rischio raggiunge il 9.2%. La frequenza di anomalie cromosomiche tra neonati è di circa 0.5%; queste anomalie rendono conto di circa 100 condizioni cliniche differenti tra cui le più conosciute sono: Sindrome di Down (trisomia 21), Sindrome di Edwards (trisomia 18), Sindrome di Patau (trisomia 13), Sindrome di Klinefelter (un cromosoma X in eccesso in un soggetto di sesso maschile), Sindrome di Turner (mancanza di un cromosoma X in un soggetto di sesso femminile). Anche l'abortività precoce ripetuta può essere conseguenza di un errore cromosomico inuno dei genitori (3-5% dei casi).Quando è opportuno eseguire lo studio citogenetico?

Quando eseguire lo studio citogenetico?

Lo studio citogenetico può essere eseguito in epoca prenatale (in corso di gravidanza) e postnatale (su campioni ottenuti da soggetti nati vivi e per convenzione anche sui nati morti, su cellule del sangue o frammento di tessuto) che include la Citogenetica dei tumori e la Citogenetica su materiale abortivo

Citogenetica prenatale

L'analisi cromosomica prenatale può essere eseguita su villi coriali, liquido amniotico e sangue fetale durante tutto l'arco della gravidanza. La scelta del tessuto da indagare è condizionata dal periodo di gravidanza, dall'indicazione clinica e dallo specifico rischio riproduttivo. È indicata nelle gravidanze che presentano un aumento del rischio di anomalie cromosomiche nel feto rispetto alla popolazione generale. In particolare:

• età materna ≥35 anni (compiuti prima della nascita del figlio)
• precedenti gravidanze con anomalia cromosomica
• genitore portatore di un'anomalia cromosomica strutturale bilanciata
• genitore con mosaicismo cromosomico
• genitore portatore di un marcatore cromosomico sopranumerario
• genitori con errori di numero dei cromosomi del sesso (es: 47,XXX; 47,XXY )
• anomalie fetali e/o segni predittivi evidenziati ecograficamente
• screening prenatale (biochimico con o senza translucenza nucale) a rischio aumentato per patologia cromosomica nel feto
• test del DNA fetale (NIPT) con risultato ad alto rischio, risultato inconclusivo o sesso discordante con l'ecografia
• rischio di malattie mendeliane da instabilità cromosomica
• anomalia a mosaico riscontrata in diagnosi prenatale su altro tessuto (es .: villi coriali)
• aborti spontanei ripetuti

Per i casi di NIPT ad alto rischio, in linea generale, il tessuto di elezione per le conferme è il liquido amniotico, salvo alcune situazioni specifiche Le tecniche di prelievo possono essere:

• villocentesi durante il primo trimestre di gravidanza (9a-12a settimana di gestazione) mediante prelievo transaddominale: vengono prelevate cellule della placenta (villi coriali) che hanno la stessa origine,e quindi lo stesso patrimonio genetico, di quelle fetali.
• amniocentesi durante il secondo trimestre (15a-18a settimana di gestazione): si studiano cellule fetali che si trovano nel liquido amniotico (amniociti)

Tra le tecniche di prelievo di materiale fetale è di gran lunga la più praticata. Si esegue di norma tra la 15a e la 18a settimana di gestazione. Consiste nel prelievo ecoguidato di circa 15-20 ml di liquido amniotico che si riformerà dopo alcune ore. Immediatamente prima dell'amniocentesi, deve essere eseguita un'ecografia in tempo reale per valutare l'attività cardiaca fetale, l'epoca gestazionale, la posizione della placenta, la localizzazione del liquido amniotico e il numero dei feti. La tecnica è molto affidabile con rischio di abortività, in seguito alla pratica, dello 0, 1%.

Citogenetica post-natale

Lo studio del cariotipo si esegue nei seguenti casi:

• soggetti con sospetta sindrome cromosomica (es. neonato con tratti corrispondenti alla Sindrome di Down quali: caratteristico aspetto del viso, anomalie cardiache, piega palmare trasversale ecc.)
• genitori e familiari di soggetti con anomalie cromosomiche
• genitori di soggetti malformati o con sospetta sindrome cromosomica deceduti senza diagnosi
• ritardo mentale e/o difetti congeniti
• ritardo dell'accrescimento
• neonati nati morti
• coppie con aborti spontanei ripetuti
• infertilità maschile
• femmine con amenorrea primaria o secondaria (assenza o interruzione del ciclo mestruale)
• sindromi mendeliane (sindromi da geni contigui o sindromi da instabilità cromosomica).

Citogenetica su materiale abortivo

Circa il 15-20% di tutte le gravidanze riconosciute esita in un aborto spontaneo Si definisce una condizione di aborto spontaneo ricorrente o abituale quando una donna va incontro a 2 o più aborti consecutivi. In questi casi di abortività ripetuta non si deve più considerare l'aborto come un evento casuale (come si può considerare il singolo episodio abortivo nella vita riproduttiva di una coppia che ottiene anche gravidanze cha vanno a buon fine). Tra le gravidanze che esitano in un aborto spontaneo, si stima che più del 50% abbia un alterato numero e/o struttura dei cromosomi e che questa sia la causa, appunto, dell'interruzione della gravidanza. Lo studio citogenetico dei tessuti abortivi è quindi di fondamentale importanza per comprendere la causa dell'interruzione della gravidanza, e risulta di fondamentale supporto alla coppia (nella maggior parte dei casi l'anomalia cromosomica è de novo, cioè puramente casuale e non comporta un rischio aumentato che l'evento si ripeta in gravidanze future della coppia). Prima di effettuare l'analisi citogenetica si consiglia la consulenza genetica, durante la quale il genetista spiega l'utilità, ma anche i limiti del test. E' inoltre fondamentale eseguire una consulenza genetica con l'esito del test citogenetico su materiale fetale per valutare l'impatto del risultato nella storia riproduttiva di coppia. I soggetti portatori di traslocazioni bilanciate hanno il rischio di sbilanciamento nella prole. Tale sbilanciamento può essere responsabile di abortività spontanea o di patologie fetali. Vi è pertanto indicazione all'esecuzione di diagnosi prenatale invasiva con la valutazione del cariotipo fetale in presenza di genitori con tale anomalia cromosomica. In presenza di un assetto cromosomico normale su materiale fetale si dovrà indirizzare la coppia all'esecuzione di un percorso di indagini per valutare le cause non fetali di abortività spontanea.

Citogenetica dei tumori

Le anomalie cromosomiche possono insorgere anche dopo la nascita, in cellule inizialmente normali (anomalie cromosomiche acquisite) e restare confinate ad un particolare tipo di tessuto, come, ad esempio, il tessuto tumorale. Lo studio citogenetico su colture cellulari di tumori solidi ha lo scopo di identificare anomalie cromosomiche specifiche dei vari tipi istologici di tumore ed è utile per la diagnosi, prognosi e scelta della terapia più adeguata. L'analisi citogenetica quindi può essere eseguita anche per studiare i tumori, sia ematologici (es. leucemie) che solidi (carcinoma mammario, carcinoma ovarico, carcinoma uterino, carcinoma della vescica, carcinoma prostatico ecc.). Certi riarrangiamenti cromosomici sono "tumore specifici" e permettono quindi una diagnosi corretta a fronte di un sospetto o dubbio clinico. Per esempio il riscontro del cromosoma Philadelphia in un aspirato midollare di un paziente con sospetta leucemia, permette di diagnosticare una leucemia mieloide cronica; oppure la presenza della traslocazione t(X;18) in una coltura cellulare allestita da biopsia di tumore solido, permette di diagnosticare un Sarcoma Sinoviale. La migliore prevenzione in genetica è l'informazione. La figura del Genetista nell'ambito della consulenza genetica è indispensabile nello spiegare ed interpretare un problema cromosomico al paziente e/o ai familiari.