Analisi microbiologica di un prodotto cosmetico: procedure e metodi

Analisi Microbiologica di un Prodotto Cosmetico

ANALISI MICROBIOLOGICA DI UN PRODOTTO COSMETICOANALISI MICROBIOLOGICA DI UN PRODOTTO COSMETICO

SCOPO: Determinare in maniera qualitativa e quantitativa i microrganismi vitali viventi presenti in un campione, verificando l'assenza di determinate specie microbiche patogene, ed esaminarne la conformità rispetto a parametri di accettabilità riportati in Linee Guida, a specifiche aziende interne o richieste dal committenteAttualmente non esistono limiti ufficiali relativi alla purezza microbiologica del prodotto cosmetico,ma .....

Se si vuole rispettare la Direttiva 76/768/CEE ..... >È necessario che: · la carica microbica del cosmetico sia mantenuta ai livelli più bassi · non siano rilevabili i microrganismi patogeni · tale condizione sia stabile nel tempo

Linee Guida e Criteri di Purezza Microbiologica

Linee Guida del COLIPA

Linee Guida del COLIPA (The European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association) Procedure da seguire durante tutto il processo di produzione del prodotto cosmetico, dalla formulazione al packaging, la cui applicazione consentirebbe di interpretare la valutazione della qualità microbiologica del prodotto cosmetico come la verifica della conformità di tutto il processo

Criteri di Purezza Microbiologica

Linee Guida del COLIPA (The European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association) I criteri di purezza microbiologica riportati sono accettati dai produttori europei e risultano molto simili a quelli emessi da altre associazioni importanti di produttori di cosmetici come: - l' americana CTFA (Cosmetics, Toiletries, Fragances Association) - e l'inglese CTPA (Cosmetic, Toiletry and Perfumery Association)

Limiti Microbiologici COLIPA, CFTA e CTPA

LIMITI MICROBIOLOGICI COLIPA, CFTA E CTPA

Microrganismi	Prodotti destinati a uso generale	Prodotti destinati a usi specifici:occhi mucose, bambini
COLIPA	Meno di 103 UFC g/ml limite massimo di accettabilità: 5 x 103 UFC/g o ml	Meno di 102 UFC g/ml limite massimo di accettabilità: 5 x 102 UFC/g o ml In 0,1 g o ml
CTFA	Meno di 103 UFC g/ml	Meno di 5 x 102 UFC g/ml P. aeuriginosa S. aureus E. coli: < 10 UFC/g o ml
CTPA	Limiti superiori: 103 UFC g/ml Limiti inferiori: 102 UFC g/ml	Limiti superiori: 102 UFC g/ml P. aeuriginosa S. aureus C. albicans Limiti inferiori: 10 UFC g/ml

Modalità Operative dell'Iter Analitico Microbiologico

Modalità operative dell'iter analitico microbiologico Quelle riguardanti una materia prima o un formulato cosmetico sono molto simili e la loro esecuzione deve essere affidata a personale competente e consapevole dell' impatto che procedure non corrette, in qualsiasi fase dell' analisi, possono avere sul risultato finale

Fasi di un'Analisi Microbiologica

Le fasi di una analisi microbiologica · Prelievo del campione · Esecuzione dell' analisi microbiologica

Prelievo del Campione

PRELIEVO DEL CAMPIONE Fase critica dell' analisi microbiologica • · Requisiti di significatività: rapporto tra quantità di analita e di prodotto · Requisiti di rappresentatività: configurare cioè tutte le caratteristiche chimico-fisiche e biologiche del prodotto · Modalità del campionamento · Numero di campioni analizzati

Fattori che Influenzano il Campionamento

Fattori che influenzano il campionamento • Distribuzione non omogenea dei microrganismi · Stratificazione dei microrganismi all'interno della massa del prodotto

Distribuzione di Tipo Contagioso

Distribuzione di tipo contagioso • Caratterizzata da microrganismi tra loro vicini riuniti in ammassi più o meno lassi, intervallati da zone con scarsa presenza microbica. · Ciò si verifica anche in un prodotto decisamente fluido come per esempio un detergente.

Contaminazione Microbica Stratificata

Contaminazione microbica stratificata Alternanza di parti di prodotto contaminate e parti non contaminate È più evidente in prodotti che: - presentano granulosità e contemporanea assenza di acqua - sono viscosi - contengono emulsioni Tali caratteristiche del prodotto costituiscono seri ostacoli allo spostamento delle cellule microbiche all' interno della massa del prodotto

Requisito Importante del Campione

Requisito importante del campione da analizzare Contenuto qualitativo e quantitativo degli stessi microrganismi presenti al momento del prelievo Quindi: - evitare di introdurre microrganismi estranei - evitare di apportare modifiche apprezzabili alla flora microbica originale sia in termini qualitativi che quantitativi - importanza del personale addetto al prelievo

Esecuzione delle Analisi Microbiologiche

ESECUZIONE DELLE ANALISI MICROBIOLOGICHE • Affidata a personale formato e addestrato · Applicazione di procedure atte a non inficiare il risultato ottenuto (e ciò dipende dal rispetto delle norme di comportamento e regolamentato all interno 7 di un laboratorio di microbiologia)

Fasi Preliminari dell'Analisi

Fasi preliminari dell' analisi Identificazione del campione • · Valutazione delle sue condizioni generali (soprattutto in termini di integrità del contenitore, registrandone eventuali difetti) Il campione viene posizionato all'interno di una cappa a flusso laminare e sottoposto a pulizia accurata e disinfezione delle superfici esterne del contenitore che verranno interessate nell' operazione del prelievo.

Prima Fase dell'Analisi Microbiologica: Preparazione del Campione

Prima fase dell' analisi microbiologica Preparazione del campione: • Rendere il campione in una forma fisica tale da poter essere utilizzato in un terreno liquido di coltura adatto e trasferire il maggior numero di microrganismi presente nella matrice cosmetica in un mezzo liquido, compatibile con il terreno di coltura stesso · Neutralizzare (polisorbato 80) eventuali conservanti presenti nel prodotto cosmetico, per evitare che questi continuano a esplicare la propria azione sui microrganismi incubati nel terreno di coltura

Modalità di Preparazione del Campione

Preparazione di un campione Le modalità di preparazione sono diverse a seconda delle caratteristiche fisico-chimiche del prodotto stesso: 1. Anidri in pasta 2. Polveri 3. Emulsioni 4. Liquidi acquosi

Preparazione del Campione in Pratica

In pratica ... • Un' aliquota di campione (10 g o ml di prodotto) viene trasferita in un contenitore sterile · Viene pesata e diluita correttamente (diluizioni seriali) con 9 aliquote di una soluzione salina isotonica, a pH neutro e tamponato, contenente sostanze in grado di neutralizzare i conservanti (mantenendo sempre lo stesso rapporto di diluizione es. 1:10) Viene quindi preparata la sospensione madre del campione dalla quale, dopo opportuna omogenizzazione, vengono approntate le successive diluizioni seriali

Preparazione di un Campione Solido

Preparazione di un campione solido 10 g Campione Pesata in sacchetto sterile 10-1 Diluente sterile (x 9)

Preparazione di un campione solido Stomacher per 1-3 minuti 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml diluente Semina . incorporamento (1 ml) C 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 · spatolamento sup. Terreno specifico Incubazione Lettura

Preparazione di un Campione Liquido

Preparazione di un campione liquido prodotti liquidi vengono diluiti con un I brodo contenente sostanze nutritive: - TSB (Tryptone Soy Broth) Al quale viene aggiunto il Polisorbato 80, agente solubilizzante che neutralizza anche alcuni conservanti chimici presenti nella formulazione (per es. i parabeni)

Preparazione di un campione liquido I prodotti con scarsa affinità per l' acqua vengono solubilizzanti premiscelandoli con il Polisorbato 80 con una spatola o pipetta sterile prima di essere diluiti con il TSB o il diluente

Preparazione di un campione liquido Campione (Tal quale) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml diluente 1:10 (10-1) 1:100 (10-2) 1:1000 (10-3) 1:10000 (10-4) 10-1 10-2 10-3 10-4

Metodi per Rilevare una Carica Microbica

Metodi per rilevare una carica microbica nei prodotti cosmetici e nelle materie prime Basati sulla tradizionale CONTA IN PIASTRA in particolare utilizzando la TECNICA DELL' INCLUSIONE per una determinazione quantitativa e come variante complementare la METODICA DI SPATOLAMENTO IN SUPERFICIE per una determinazione quali-quantitativa

Fase di Interpretazione del Risultato

FASE di interpretazione del risultato In generale la determinazione dei microrganismi vitali viene effettuata contando tutte le colonie sviluppatesi sulle piastre contenenti un numero compreso tra • 15 e 300 colonie per BATTERI • 10 e 100 colonie per LIEVITI e MUFFE

Calcolo del Conteggio

FASE di interpretazione del risultato conteggio viene effettuato applicando la formula, indicata nella Norma ISO* 7218, che rappresenta la media ponderata delle conte di due diluizioni successive *ISO: Ente di Standardizzazione Internazionale (International Organization of Standardization)

Formula per il Conteggio

FORMULA N= EC V x (n1 + 0,1 x n2) xd N= n. di microrganismi presenti nel campione EC= somma della conta delle colonie in tutte le piastre considerate alle 2 successive diluizioni V= volume di inoculo di ciascuna piastra n1= n. delle piastre alla prima diluizione considerata n2= n. delle piastre alla seconda diluizione considerata d= diluizione dell' inoculo distribuito nella prima piastra presa in considerazione

Esempio di Calcolo

ESEMPIO Rilevamento di · 168 e 215 colonie nelle due piastre ottenute seminando per inclusione di 1 ml di una sospensione diluita 1:1000 · 14 e 25 colonie contate nella successiva diluizione 1:10.000 Il calcolo è N= 168+215+14+25 x 1 1 x (2 + 0,1 x 2) 0,001 da cui N= 422/2,2 x 1000 N= 191818 1,9 x 105

A tale risultato è possibile attribuire il valore dell incertezza di misura che, per determinazioni microbiologiche, viene calcolato come intervallo di fiducia al 95% di probabilità.

- Nei prodotti cosmetici è frequente rilevare la presenza dei microrganismi solo nelle piastre corrispondenti alla prima diluizione eseguita (sospensione madre), con un numero di colonie inferiore alle 15 UFC. - In questo caso l'intervallo di fiducia viene ricavato dalla tabella riportata nella ISO 7218

Tabella ISO 7214

TABELLA ISO 7214

Numero di UFC	Limite di confidenza al 95% Inferiore	Superiore
1	< 1	2
2	< 1	4
3	< 1	5
4	1	6
5	2	9
6	2	10
7	2	12
8	3	13
9	4	14
10	4	16
11	5	18
12	6	19
13	7	20
14	7	21
15	8	23

Metodica della Diluizione in Serie o MPN

Metodica della diluizione in serie o MPN (Most Probable Number) Si basa sul calcolo statistico del numero più probabile di microrganismi presenti in un campione attraverso la realizzazione di diluizioni seriali del campione in un terreno nutritivo liquido.

Metodica della diluizione in serie o MPN (Most Probable Number) • Ciascuna diluizione viene seminata in triplo, quindi per la lettura, si considerano le ultime tre diluizioni in cui si è verificata crescita e, per ciascuna diluizione si riporta il numero di provette positive. · Si ottiene così un numero caratteristico. · Si ricerca sulle tavole di Mc Rady questo numero che corrisponderà ad un certo quantitativo di microrganismi. · Tale numero deve essere moltiplicato per il reciproco della prima diluizione considerata nella lettura. · Il valore ottenuto sarà il numero di microrganismi per g o ml di prodotto.