Le tecnologie del DNA ricombinante: dalla storia alla PCR

Tecnologie del DNA ricombinante

Capitolo B5
Le tecnologie del
DNA ricombinanteSeconda metà dell'800
Prima metà del 900
Il DNA e i Geni dell
Sc
Collaborazione Straord
Watson, Crick, Franklin a Will

L'esperimento di Cohen e Boyer (1973)

1973
91997 H.MITCHELL
1
STANLEY COHEN
HERBERT BOYER
Tecnologia
del DNA
ricombinante
(ingegneria
genetica)kanR
tet®
Plasmide
di E. coli
-C
2. Entrambi i plasmidi
sono tagliati con enzimi e
poi ricuciti insieme dalla
DNA ligasi.
kanR
tetR
O
1. Ciascuno di questi
due plasmidi di E. coli
contiene un gene per
la resistenza a un
antibiotico: kanamicina
(kanR) o tetraciclina (tetR).
I plasmidi sono
molecole di
DNA circolare
indipendenti
dal cromosoma
batterico.
Figura 1
L'esperimento di
Cohen e Boyer
Due frammenti
di DNA con geni
diversi possono
essere uniti in
un'unica molecola di
DNA ricombinante.
3. Si forma una molecola
di DNA ricombinante,
cioè un nuovo plasmide
che contiene sia il gene
kan® sia tet®.
4. Le cellule che ricevono
il plasmide ricombinante
sopravvivono in presenza
di entrambi gli antibiotici.

Biotecnologie

Biotecnologie
Insieme delle tecniche che utilizzano organismi
viventi per lo sviluppo di processi o prodotti
utili

Il DNA ricombinante: definizione e applicazioni

1. Il DNA ricombinante /1
Un DNA ricombinante è una molecola di DNA che contiene
l'informazione genetica proveniente da due o più organismi
differenti.
Le biotecnologie hanno molte applicazioni, ma nella maggior
parte dei casi la prima operazione da compiere è il clonaggio
genico ovvero la produzione di numerose copie di un gene di
interesse mediante le tecniche del DNA ricombinante.

Requisiti per il clonaggio genico

Per un clonaggio occorre:
· il gene da clonare;
· gli enzimi per «tagliare» e «cucire» il DNA;
· un vettore di clonaggio.

Fasi del clonaggio

Il clonaggio richiede:
•
l'isolamento di una particolare sequenza di DNA
(non necessariamente codificante per una proteina)
dall'insieme di tutte le sequenze del DNA di un
organismo (genoma);
· l'inserimento della sequenza di DNA in una cellula
ospite, spesso diversa da quella da cui origina il DNA
da clonare, tramite l'utilizzo di molecole di DNA
trasportatrici (vettori molecolari);
· la moltiplicazione delle cellule riceventi;
· la selezione delle cellule che effettivamente
contengono la sequenza del DNA di interesse.

L'isolamento del DNA da clonare

L'isolamento
Il DNA da clonare può essere un segmento del
genoma oppure una copia a DNA di un RNA
messaggero (mRNA).
Nel primo caso è possibile isolare anche sequenze
non codificanti, come i promotori o gli introni presenti
all'interno dei geni eucariotici.
Nel secondo invece si può prelevare solo la sequenza
espressa di un gene, allo scopo di fare esprimere la
proteina corrispondente in un organismo diverso da
quello originario: è questo l'approccio più usato in
biotecnologia.

Enzimi e vettori per il DNA ricombinante

1. Il DNA ricombinante /2
La creazione di una molecola di DNA ricombinante richiede due
tipi di enzimi che catalizzano le reazioni di «taglio» e «cucitura»:
· Enzimi di restrizione: endonucleasi che rompono in modo
preciso il legame fosfodiestere tra due nucleotidi adiacenti.
- l'elettroforesi su gel d'agarosio permette di separare i
frammenti di DNA in base alle loro dimensioni.
· DNA ligasi: enzimi che catalizzano la formazione del legame
fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti.
Il gene viene poi inserito in un vettore di clonaggio:
molecola di DNA ricombinante che entra in una cellula e si
replica generando molte copie di se stessa.
I vettori di clonaggio più usati sono i plasmidi.

Caratteristiche degli enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione:
•
Sono endonucleasi.
•
Idrolizzano il legame
fosfodiesterico
•
Tagliano entrambi i
filamenti
•
Riconoscono
sequenze palindrome
•
Servono per isolare
frammenti di DNA
compresi tra siti di
taglio
Formation of phosphodiester bond
0-
-0-P=0
0
1
5CH2
O
14
1
3
2
OH OH
O
OH
"O-P=O Phosphodiester + H2O
bond
OH
"O-P=0
1
5CH2
O
5CH2
0
-
4
1
3
2
OH OH
0-
-O-P=0
Ò
CH2
0
3
OH OH

Enzimi di restrizione comunemente usati

Ten Commonly Used Restriction
Enzymes
Enzyme
Sequence of
Recognition Site
Microbial Origin
Taql
5
T
CGA 3
Thermus aquaticus YTI
Rsal
5
GTAC
Rhodopseudomonas
sphaeroides
3
CATG
5
Sau3Al
5
GAT
3
Staphylococcus aureus 3A
3°.
CTAG5
EcoRI
5' GAATTC
3
3º
CITTAAG5
BamHI
5
G
GATCC
3°
C
C
TA
G
.5
HindIll
5
A
AGCTT
3
3º
TTCGAA
5
Kpnl
5º
GGTACC
3
C
C
AT
GG
5
Clal
5
A
T
CGAT
3º
Caryophanon latum
3'
TI
AIG
C
TA
5
BssHII
5°
G
C
G
C
G
C
3
Bacillus
stearothermophilus
Notl
5
G
C
G
Nocardia otitidiscaviarum
3.
C
G
G
5
Bacillus
amyloliquefaciens H.
3
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
OK8
3"
C
G
C
G
C
G
5
3'
C
G
C
AGCT 5
3
Escherichia coli
3

Modalità di taglio degli enzimi di restrizione

Come taglia un enzima di
restrizione?
Endonucleasi
di restrizione
EcoRI
Endonucleasi
di restrizione
Pvull
... GGTG
. CCACTTAA
AATTCAGC ... TAGCAG
GTCG ... ATCGTC
CTGTAGC ...
GACATCG ...
Estremità coesive
Estremità piatte

Elettroforesi su gel di agarosio

Un gel di agarosio
è posizionato in
una camera tra due
elettrodi,
1
Le cavità presenti nel gel (pozzetti) vengono riempite
con le soluzioni di DNA.
2
gel
+
soluzione
tampone
soluzione
di DNA
enzima 1
enzima 2
enzimi
1+2
A
8
D
A
ED
L'enzima di restrizione 1
taglia il DNA una volta,
producendo due frammenti
AeB
3
L'enzima di restrizione 2
taglia il DNA una volta, in un
sito di restrizione diverso
Se vengono usati entrambi
gli enzimi di restrizione,
vengono fatti due tagli nel
DNA
5
-
2 1+2
1
2
1.2
frammenti
più lunghi
E
Dopo l'incubazione
con l'enzima, ogni
campione viene
caricato in un
pozzetto del gel.
6
A
A
frammenti
più corti
4
Mentre | frammenti
di ONA si muovono
verso il polo positivo,
I frammenti più
corti si muovono
più velocemente
(e quindi vanno
più lontano) del
frammenti più
lunghi
Elettroforesi
Matrice del gel:
-Agarosio (polimero del galattosio)
-Poliacrilammide (polimero di
acrilammide) Separa frammenti
più piccoli di DNAI
Frammenti di DNA
DNA genomico

Taglio e saldatura del DNA con EcoRI e DNA ligasi

EcoRI taglia i due filamenti di un DNA
in due punti diversi, a livello di una
sequenza di riconoscimento palindroma.
1
EcoRI taglia a livello
delle due frecce rosse
DNA
5' CGATCCAGGAATTCATCCAGCC
3'
3' GETAGGTCCTTAAGTAGGTCGG
5'
AGGCTCTAGAATTCTTCTAGCT
TCCGAGATOTTAAGAAGATCGA
CGATCCAGG
GETAGGTCCTTAA
AATTCATCCAGCC
GTAGGTCGG
AGGCTCTAG
TCCGAGATCTTAA
AATTCTTCTAGCT
GAAGATCGA
2
CGATCCAGGAATTCTTCTAGCT
GETAGGTCCTTAAGAAGATCGA
I due
frammenti
separati del
DNA portano
appendici
di basi non
appaiate, che
costituiscono
estremità
coesive.
3
Le estremità coesive possono
unirsi mediante legami a
idrogeno con estremità coesive
complementari derivanti da altri
DNA; il DNA ricombinante che
ne risulta può essere saldato
dall'azione della DNA ligasi.
Figura 3 Come si taglia, si unisce e si salda il DNA Due
frammenti di DNA (in azzurro e arancione) possono essere
tagliati con un enzima come EcoRI e ricuciti con una DNA
ligasi per formare un frammento di DNA ricombinante.

Funzione della DNA ligasi

Ligasi
•
Ricostituisce il legame
fosfodiesterico tra 2
nucleotidi (usando ATP)
•
Saldano sia estremità
sticky che blunt
•
Le estremità piatte sono
saldate con minore
efficienza perché i
frammenti non si
appaiano
spontaneamente.

Vettori plasmidici

Vettori Plasmidici
HindIII
Pstl
-BamHI
gene reporter
della resistenza
all'ampicillina
(amp?)
Sall
origine di replicazione (ori)
gene reporter
della resistenza
alla tetraciclina
(tetR)
· Sono molecole a ds di DNA di piccole dimensioni
· Facilmente purificabili
· Possiedono un marcatore selettivo (Marker) (es
resistenza agli antibiotici)
· Sono capaci di replicarsi autonomamente (ORI)
· Possiedono una zona dove si può inserire DNA esogeno
(polylinker o MCS- sito multiplo per il clonaggio)

Virus come vettori: vettori virali

Virus come vettori: vettori virali
Derivati dal fago A
Vantaggio: accettano frammenti di DNA più
grandi rispetto ai plasmidi
Esistono anche vettori retrovirali: inseriscono
stabilmente un gene clonato nel cromosoma
della cellula ricevente

Vettori di espressione

Vettori di espressione
Consentono di introdurre un gene in una
cellula batterica ricevente e di farlo
esprimere ad esempio in una cellula
eucariotica
ori
pGLO
5400 bp
amp
gfp
Il vettore plasmidico porta il gene per la
proteina fluorescente verde (GFP).
Le cellule batteriche che ospitano il
plasmide producono la GFP e brillano
sotto la luce ultravioletta.
Esempio GFP

Esercizio: digestione di un plasmide

Esercizio: Quali frammenti sono attesi dalla
digestione di questo plasmide con i seguenti
enzimi di restrizione?
Not1
Not1/EcoRI
SmaI
SmaI/EcoRI
Not1
EcoRI
SmaI
4Kb
Not1

Disegno dei frammenti attesi sul gel

Disegna i frammenti attesi sul gel.
Marcatore
Not1
EcoRI/Not1
Smal
Smal/EcoRI
10kb
8kb
6kb
6Kb
5kb
5Kb
4kb
4Kb
3kb
3Kb
2kb
2Kb
1 kb
1Kb
0.5kb
0,5Kb
二

Soluzioni dell'esercizio di digestione

Soluzioni:
Digestione con:
- NotI - 2 frammenti : 1000b e 3000 b
- NotI/EcoRI - 3 frammenti: 3000 b + 2 x 500 b
- Smal - 1 frammento da 4000 b
- Smal/EcoRI - 2 frammenti: 1500 b e 2500 b

Risultati sul gel

Marcatore
Not1
EcoRI/Not1
Smal
Smal/EcoRI
10kb
8kb
6kb
6Kb
5kb
5Kb
4kb
4Kb
-
3kb
3Kb
-
I
2kb
2Kb
-
1 kb
1Kb
-
- 0.5kb
0,5Kb

Clonaggio di un gene

Clonaggio di un gene
DNA campione contenente
il gene dell'insulina
Batteri che hanno
incorporato il plasmide vuoto
Batterio che ha incorporato
il plasmide ricombinante
BamHI
Taglio con
enzima BamHI
1. Il frammento di DNA contenente il
gene dell'insulina viene tagliato con
l'enzima BamHI.
ampR
BamHI
Gene lacZ' interrotto
lacZ'
Il gene dell'insulina è inserito
in un plasmide di clonaggio
BamHI
I batteri sono coltivati
su un mezzo
contenente ampicillina
e X-gal
Aggiunta
dell'enzima ligasi
Plasmide
Gene per
l'insulna
Plasmide
Plasmide vuoto ricombinante
4. I batteri con il plasmide
ricombinante sono quelli
che formano colonie
incolori. I batteri con
plasmide non ricombinante
si riconoscono perché
metabolizzano X-gal e
formano colonie blu.
La colonia bianca contiene
il gene per l'insulina ed è usata
per gli esperimenti successivi
2. I frammenti ottenuti sono saldati
con la DNA ligasi all'interno del
plasmide.
3. Con la trasformazione si
inserisce il DNA plasmidico nei
batteri, ma solo alcune cellule
incorporano il plasmide.
5. A partire da questi batteri
ricombinanti si possono
preparare colonie pure di cloni
batterici che contengono il
vettore con il gene dell'insulina.
Figura 9 Clonaggio di un gene
Le tappe di un esperimento di clonaggio del gene dell'insulina all'interno di un plasmide.

PCTO: Attività pratiche

PCTO:
1) Imparare ad utilizzare le micropipette
2) Elettroforesi con coloranti
3) Come si clona un gene?
4) Elettroforesi su gel per verificare la ligazione
3)
Restriction Enzymes
digestion
rfp
rfp
Plasmid
DNA
Gene of interest
Amgen Biotech Experience
Scientific Discovery for the Classroom