Cromatografia: metodo analitico per la separazione di miscele complesse

Cromatografia: Metodo Analitico

La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione di miscele complesse in elementi singoli, alla quale si abbina una tecnica di rivelazione che permette l'identificazione e la determinazione qualitativa e quantitativa dei componenti. I metodi cromatografici sfruttano la distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l'altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa. La separazione dei componenti della miscela dipende dalla loro differente velocità di migrazione conseguentemente alla loro affinità. In particolare, le sostanze più affini alla fase stazionaria sono più trattenute e quindi il loro trascinamento risulta lento e al contrario sostanze più affini alla fase mobile sono più facilmente eluite.

Tipi di Cromatografia

TIPI di CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA Adsorbimento COLONNA PLANARE GC Ripartizione SFC TLC Elettroforesi LC Carta Esclusione Scambio ionico CCE Adsorbimento Ripartizione Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)

Definizioni Cromatografiche

GC: gas cromatografia LC: cromatografia liquida SFC:cromatografia a fluido supercritico TLC: cromatografia su vetro, alluminio, o plastica

Procedimento Cromatografico

• il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico;
• la fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria;
• la fase stazionaria (liquida o solida) si trova all'interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana;
• la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi;
• i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema, i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente;
• la separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi

Interazione Soluto-Fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

• legami a idrogeno
• interazioni dipolo-dipolo
• interazioni dipolo-dipolo indotto
• forze di Van der Waals
• formazione di composti di interazione (es. Ag-Ab)
• attrazione colombiana
• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico

Cromatogramma

Le separazioni cromatografiche strumentali (HPLC e GC) si concludono con la registrazione del cromatogramma, ovvero del tracciato del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente, a partire dall'istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t=0)

Parametri della Cromatografia

I parametri della cromatografia sono i seguenti: Tempo di ritenzione tR: tempo impiegato da ciascuna sostanza per eluire dalla colonna, misurato a partire dall'istante in cui la miscela viene introdotta nello strumento fino all'istante in cui si registra il massimo del picco (in alternativa si può utilizzare il volume di ritenzione). Ogni sostanza ha un tR caratteristico. Tempo morto tM o t0 è il tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria. Produce un picco detto Fronte di solvente Volume morto VM (detto anche volume della fase mobile) corrisponde al volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria. Tempo di ritenzione corretto: tempo che ogni sostanza impiega per le interazioni con la fase stazionaria (t'R = tR -tM) Volume di eluizione: si riferisce al volume di fase mobile richiesto per eluire un componente (VR = F . tR dove F è la velocità di flusso) Il processo cromatografico è regolato dall'affinità dei vari analiti per la fase stazionaria. Può capitare durante alcune sedute analitiche di assistere a uno spostamento nel tempo di ritenzione, in questi casi si può utilizzare al posto del tempo di ritenzione un parametro definito Fattore di capacità o Fattore di ritenzione calcolato mediante la seguente formula: k', = tx-to to Tale parametro elimina le piccole interferenze dovute al t0 che possono far cambiare il tempo di ritenzione di una stessa sostanza.Le sostanze si ripartiscono tra la fase stazionaria e la fase mobile secondo un equilibrio dinamico in quanto la molecola che è in fase stazionaria non rimane fissa ma continua a passare da fase stazionaria a fase mobile e viceversa.

Equilibrio Dinamico

Analita fase mobile Analita fase stazionaria Direction of Flow Solute Transferring From the Stationary Phase to the Mobile Phase at the Back of the Peak Profile Profile of Solute Concentration in the Mobile Phase Profile of Solute Concentration in the Stationary Phase Stationary Phase Le sostanze sciolte nella fase mobile interagiscono con la fase stazionaria mediante Kd "coefficiente di ripartizione" o "coefficiente di distribuzione" o "costate di ripartizione" dove : Ka = Canalita in fase stazionaria Canalita in fase mobile

Risoluzione Cromatografica

Risoluzione di una separazione cromatografica Una buona risoluzione cromatografica (R) significa una buona separazione tra i due picchi contigui e dipende dalla selettività e dall'efficienza

Selettività

Selettività: definisce la capacità di una colonna di separare due componenti in base alla loro affinità per la colonna. Consente tempi di ritenzione molto diversi e può essere aumentata a = 1'? K'1 abbassando la temperatura della colonna. La selettività da sola non è sufficiente per una buona risoluzione qualora i picchi sono larghi e tali da sovrapporsi

Efficienza

Efficienza: indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande e quindi picchi stretti. L'efficienza esprime l'allargamento del picco per motivi pratici, si preferisce calcolare N: numero dei piatti teorici tr N=16. 2 w = larghezza del picco alla base 11

Altezza Equivalente ad un Piatto Teorico (H)

ALTEZZA EQUIVALENTE AD UN PIATTO TEORICO (H): è un parametro traslato dalla teoria della distillazione e corrisponde al numero di equilibri o pertizioni del soluto nella colonna L dove H è l'altezza teorica del piatto, L è la lunghezza della colonna in mm ed N è il numero H == di piatti teorici. Maggiore è N, più basso è il piatto e migliore è l'efficienza. L'equazione che correla tutti questi parametri è: a-1 R == VN 4 1 X a k' k'+1 Efficienza della colonna Selettività Capacità

Ottimizzazione della Risoluzione

Il valore minimo di R è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%). Per Rs= 1.5 (sovrapposizione dello 0.3%) la separazione è considerata completa. Riassumendo, per ottenere un'alta risoluzione, occorre: · aumentare il numero di piatti teorici, aumentando la lunghezza della colonna, o meglio, riducendo l'altezza del piatto teorico (riducendo la dimensione delle particelle della fase stazionaria). · scegliere una coppia di fasi che assicurino k tra 1,5 e 5. · abbassare la T · Si può anche lavorare a temperatura programmata (in GC), in gradiente di polarità (in HPLC) o agendo sulla pressione (in SFC)

Equazione di Van Deemter

Equazione di Van Deemter : HETP (altezza equivalente al piatto teorico) derivata dalla teoria del non-equilibrio, il non rispetto totale delle Kd B HETP=(A)+ Cu Resistenza al trasferimento di massa 11 Diffusione vorticosa Diffusione longitudinale u = velocità lineare della fase mobile H (cm) H = A + B/u + C.u C.u Resistenza al trasferimento di massa del piatto teorico Altezza minima Percorsi multipli (diffusione di Eddy) Diffusione longitudinale 1 A B/u Velocità ottimale Velocità lineare U (cm/s)

Diffusione Vorticosa (Percorsi Multipli)

Diffusione vorticosa (o percorsi multipli) Le inevitabili differenze di dimensioni delle particelle solide che costituiscono la fase stazionaria (o il supporto che la sostiene) fanno procedere le molecole della sostanza in analisi secondo strade diverse. Nel loro moto casuale, alcune molecole arriveranno prima, altre dopo, con il più veloci più lente risultato globale di far allargare la banda in uscita dalla colonna. Con una fase stazionaria formata da particelle piccole (ma non troppo da causare tempo l'intasamento della colonna) e con granulometria costante si riduce questo problema, in quanto gli analiti faranno grossomodo lo stesso percorso utilizzando quasi lo stesso tempo per uscire dalla colonna, stringendo quindi la base del picco. La diffusione multivorticosa è costante. Indipendentemente dalla velocità con cui la fase mobile trasporta le molecole della sostanza attraverso la fase stazionaria, la loro differenziazione avverrà sempre con la stessa distribuzione. Nell' equazione di Van Deemter il parametro che rappresenta questo fenomeno è indicato con A = 22dp dove · ) è una costante associata alla granulometria (diametro delle particelle e loro distribuzione granulometrica) e all'impaccamento della colonna · dp il diametro medio delle particelle di riempimento Il valore A incide poco sul valore di H

Diffusione Molecolare Longitudinale

Diffusione molecolare longitudinale Le molecole della sostanza diffondono sia nella fase mobile sia in quella stazionaria. Tendono cioè a passare spontaneamente da zone a concentrazione più alta a quelle a concentrazione più bassa secondo una direzione longitudinale, quella appunto di avanzamento della fase mobile. Il fenomeno è tanto più favorito quanto meno è viscosa la fase e per questo stesso motivo è più accentuato nella fase mobile che in quella stazionaria. Anche il tempo di permanenza è importante: più a lungo la sostanza rimane nella colonna e più tempo ha a disposizione per diffondere. Per minimizzare questo fenomeno occorrono flussi elevati (ma non troppo perché si possono verificare problemi per la pressione) e fluidi viscosi; anche le basse temperature aiutano poiché aumentano la viscosità delle fasi. Nell' equazione di Van Deemter il parametro che rappresenta questo fenomeno è indicato con B = 2yDM dove · y è il fattore di tortuosità, che dipende dall'impaccamento della colonna (vale a dire dalla geometria degli spazi disponibili per la fase mobile). Per ridurre il valore di y occorre usare particelle di dimensioni uniformi (l'impaccamento risulta più compatto e si riducono gli spazi in cui la fase mobile può consentire il fenomeno della diffusione longitudinale). · DM il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile, un parametro che riassume tutte le caratteristiche che influenzano la sua resistenza alla diffusione: densità e viscosità Poiché valori alti di entrambe portano a piccoli coefficienti di diffusione, si spiega perché tale fenomeno sia più accentuato con un gas che con un liquido; la viscosità in un liquido è di 2 ordini di grandezza più alta rispetto a quella di un gas, come d'altronde la densità che aumenta di 3. DM in un liquido risulta essere nell'ordine di 10-5 quindi trascurabile, mentre in un gas di 10-1 non trascurabile. La variabile U, che compare al denominatore, suggerisce di aumentare il flusso per minimizzare il contributo del termine al valore complessivo di H. [Il termine B/U in HPLC si può trascurare mentre è importante in GC]

Resistenza al Trasferimento di Massa

Resistenza al trasferimento di massa Il terzo parametro C da cui dipende l'efficienza di una colonna è associato alla resistenza al trasferimento di massa: un equilibrio ha bisogno di tempo per instaurarsi. Il suo contributo al valore complessivo di H è il più importante di tutti gli altri. All'inizio le molecole di analita più vicine alla fase stazionaria diffondono dalla fase mobile alla fase stazionaria. La velocità di diffusione dipende dalla diffusività dell'analita. Le molecole rimaste